液態(tài)活檢在非小細胞肺癌靶向治療中的研究進展

趙玲, 易善永, 閆曉倩, 郜輝

近年來,分子靶向治療在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的綜合治療中占極重要的地位,腫瘤個體生物學特性的差異是個體化治療的基礎,比如針對在NSCLC中檢測到的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、棘皮動物微管相關類蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein-llike 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)和ROS1(repressor of silencing 1)等基因的個體化治療[1-3],為肺癌的治療掀開了新的篇章。目前臨床上針對肺癌的靶向治療藥物主要有表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)和作用于EML4-ALK、ROS1靶點的克唑替尼。研究證明,EGFR突變及ALK基因融合表達的患者接受相應靶向治療的療效優(yōu)于含鉑的兩藥化療方案,然而在靶向治療過程中,一些突變耐藥基因的出現會直接導致治療的失敗,如T790M突變[2];因此,在治療前了解基因突變的狀態(tài),以及在治療過程中實時動態(tài)檢測耐藥基因的出現對NSCLC的個體化治療尤為重要。

臨床上最常用的肺癌基因檢測標本是組織學標本,但只有約30%的患者能夠獲取足夠的組織標本進行檢測。取材不方便、開展實時活檢很難被患者接受,尤其是身體狀況較差的患者。而液態(tài)活檢是對腫瘤患者的體液進行檢測,主要是通過檢測腫瘤細胞釋放到體液中的標志物信息來獲得患者體內腫瘤基因或蛋白表達的信息。液態(tài)活檢的主要檢測標本是血液、尿液和唾液等[4-5]。目前臨床上通過血液檢測的主要有循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)、腫瘤衍生外泌體(tumor-derived txosomes, TEXs)、循環(huán)腫瘤RNA(circulating tumor RNA, ctRNA)、血漿蛋白和代謝物等[6-7],而臨床上最常檢測的是ctDNA、CTCs和TEXs。液態(tài)活檢是一種非侵入性的檢測方法,取材方便,容易被患者接受,成為目前臨床上最有應用前景的腫瘤組織標本替代品;現將液態(tài)活檢技術在NSCLC分子靶向治療中的研究進展綜述如下。

1 ctDNA

1.1 ctDNA的概述 1948年,Mandel和Métais發(fā)現人的外周血中可檢測到循環(huán)游離DNA。1977年,研究人員在腫瘤患者體內發(fā)現了循環(huán)腫瘤DNA的存在;1994年,在腫瘤患者的外周血中檢測到了癌基因RAS的變異,表明部分循環(huán)DNA來自于腫瘤。ctDNA主要有3個來源:凋亡和壞死的腫瘤細胞、CTCs和TEXs[8-9]。研究證實在多種腫瘤患者的外周血中檢測到ctDNA,它與腫瘤組織的DNA具有高度的一致性,并且其濃度與腫瘤的大小、分期呈正相關[8-10]。此外,ctDNA的檢測也能輔助對肺癌的診斷與分期,并可指導肺癌的個體化用藥及對耐藥性的分析。

1.2 ctDNA的檢測方法 由于來自正常組織的DNA含量較高,而細胞游離DNA只是其中的一小部分,因此獲得和分析ctDNA要比CTCs難度更大。目前,ctDNA的檢測方法主要包括:突變擴增系統(amplification refractory mutation system, ARMS)、二代測序(next generation sequencing, NGS)和微滴式數字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)。以ddPCR和NGS為基礎的DNA突變檢測技術日趨發(fā)展成熟。ddPCR技術已普遍用于檢測靶向DNA突變,雖然基于PCR的技術具有很高的靈敏度,可用于監(jiān)測低至0.01%的腫瘤相關基因突變,但該技術只能檢測有限數量的病灶[11-12]。因此,ddPCR技術在監(jiān)測過程中可能會遺漏大量信息。NGS技術能更全面的獲得整個基因組區(qū)域的信息,它提供了個體化癌癥基因圖譜的特征和開發(fā)個體化醫(yī)學的機會。在越來越多的驅動程序突變測試的背景下,NGS表現出了更多的優(yōu)勢,因為它可以更高效的同時檢測多個基因的突變。Rothé等[8]首先在晚期乳腺癌患者中進行了深入覆蓋的NGS檢測,檢測了50個基因熱點區(qū)域的突變,并在24%的患者中發(fā)現了原發(fā)腫瘤的DNA與血漿之間的不一致突變。但由于其成本較高,尤其是數據管理的復雜性,該技術的臨床應用受到了一定的限制。相信在不久的將來,隨著基因組技術和生物信息學靈敏度的不斷提高,NGS技術能夠在ctDNA分析應用中發(fā)揮核心作用。

1.3 ctDNA在肺癌靶向治療中的應用 ctDNA在腫瘤的診斷、腫瘤分子異質性、腫瘤動態(tài)變化的監(jiān)測、尋找靶點、療效評價和預后評估等方面具有重要的價值。2015年歐洲肺癌年會公布了IGNITE研究結果[9],該研究檢測了2 581例NSCLC患者的組織學或細胞學標本與ctDNA標本的EGFR突變率,結果顯示,ctDNA標本和組織學或細胞學標本檢測具有很高的一致性,且ctDNA具有較高的特異性,在亞太地區(qū)的患者中可以達到97.2%。Luo等[10]對20項研究進行Meta分析發(fā)現,采用ctDNA與腫瘤組織活檢對EGFR進行檢測具有同樣的診斷準確性。Qiu等[13]對27項相關研究進行Meta分析也發(fā)現,ctDNA檢測的總敏感度為62%,特異度為96%。存在驅動基因突變的NSCLC患者可以接受相應的靶向治療,但目前的靶向治療藥物,無論是EGFR-TKI還是ALK抑制劑均會在1年左右出現耐藥,對EGFR-TKI藥物敏感的患者,當出現病情進展時,約40%～60%的患者存在T790M突變。近期的一項研究通過組織標本檢測到T790M突變率為47%,通過液態(tài)活檢(CTCs、ctDNA)檢測到突變率為50%,具有很高的檢測一致性[14]。而對于這部分患者耐藥性的準確判定,實體瘤療效評價標準(RECIST)可能并不完全適用。所以通過液態(tài)活檢獲得耐藥基因的表達情況成了目前研究的重點方向之一。Sorensen等[15]采用PCR技術檢測23例進展期NSCLC患者的血漿EGFR表達情況,發(fā)現EGFR突變患者對厄洛替尼有42種不同的敏感性表達,在厄洛替尼應用前后均進行檢測,結果顯示96%的患者在治療開始階段L858R突變或19外顯子缺失呈下降趨勢,沒有檢測到T790M突變,但隨著治療的進行,39%的患者出現了T790M突變,因此,對T790M的持續(xù)監(jiān)測能夠較早發(fā)現肺癌患者的進展;對T790M突變陽性的NSCLC患者臨床上可應用第三代TKIs靶向治療。2015年發(fā)表在Nature Medicine雜志上的關于三代EGFR-TKIs耐藥機制的研究對15例T790M突變的患者給予AZD9291治療,隨訪并動態(tài)監(jiān)測ctDNA的變化,發(fā)現并證實了AZD9291獲得性耐藥的突變位點C797S[16]。AZD9291存在3種耐藥模式,一種是耐藥后T790M突變與C797S突變同時存在,另一種是耐藥后僅出現T790M的再次升高,第三種是耐藥后既不伴有T790M也無C797S的出現[15-16]。液態(tài)活檢可用于肺癌靶向治療效果及預后的預測。Imamura等[17]對52例EGFR突變陽性且首次給予EGFR-TKI治療的NSCLC患者治療期間進行血液EGFR突變檢測,同時采用CT掃描與RECIST標準評價療效,結果顯示患者血漿ctDNA水平與RECIST評價結果相吻合,表明ctDNA檢測可評價EGFR-TKI治療效果。Yang等[18]對73例晚期肺腺癌患者行EGFR-TKI治療前后的血漿樣本進行ctDNA檢測,結果顯示74%的樣本檢測到了EGFR突變,EGFR突變陽性患者比野生型患者的預后更好,且EGFR高突變豐度(>5.15%)的患者相比于低突變豐度(≤5.15%)患者呈現了更好的預后。近年來,有研究表明可以通過ctDNA檢測肺癌免疫抑制劑療效的分子標記物如腫瘤突變負荷(tumor mutation burden, TMB)。Gandara等[19]研究發(fā)現通過檢測血液樣本中的TMB(bTMB)可以很好的預測患者能否從PD-L1抗體治療中獲益。研究人員先對兩個臨床隊列的bTMB與組織樣本的TMB(tTMB)進行比較,確定了在整體上tTMB與bTMB確實呈正相關的關系,表明bTMB確實能夠作為免疫治療的潛在非侵入性生物標志物。

2 CTCs

2.1 CTCs的概述 1869年,澳大利亞學者Thomas Ashworth從一位轉移瘤患者的外周血中發(fā)現了CTCs。諸多研究認為,腫瘤的原發(fā)或轉移病灶脫落到外周血的細胞就叫CTCs,它可通過淋巴和血液系統決定腫瘤細胞向其他部位轉移。目前已經證實CTCs在各種實體腫瘤患者的血液中廣泛存在,并與肺癌患者的轉移以及其他腫瘤的預后不良密切相關[20-21]。

2.2 CTCs的檢測方法 在早期腫瘤患者血液中CTCs含量很少,即使在晚期腫瘤的患者每106～107個外周血細胞中也才發(fā)現一個CTCs,所以通過普通的檢測方法很難進行檢測。CTCs的檢測流程主要分為兩部分:CTCs的富集及CTCs的檢測。最常用的CTCs分離方法是抗體介導的腫瘤細胞捕獲技術,CellSearchTM是美國FDA批準的唯一檢測CTCs的方法,它利用上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)涂層磁珠分離CTCs,但研究表明這種檢測方法在幾種類型的腫瘤中檢測效率卻很有限。而一種獨特的微流控平臺“CTCs芯片”能夠有效并選擇性地從外周血標本中分離出具有活性的CTCs,CTCs芯片由一個微流控平臺(針對EpCAM或MUC 1的抗體)組成,它與CTCs相互作用和捕獲,提高了靈敏度,簡化了預標記樣品的步驟,這項技術成功地檢測到了約100%的肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和結腸癌的CTCs[20-22]。雖然這種檢測技術有很多優(yōu)點,但是有一些腫瘤細胞亞群仍不能被檢測到,可能是因為這些細胞進行了上皮-間充質轉化。因此,有研究認為需要將這兩種技術結合起來進行聯合分析,才能夠提高CTCs的檢測敏感度。其他的檢測方法還有逆轉錄PCR、酶聯免疫檢測及自動顯微鏡系統,最近一項新的檢測方法四氯化碳分離技術被開發(fā)出來,其可以在很低的濃度下分離CTCs,希望在不久的將來這項技術能真正應用于臨床。對于獲取的CTCs,可以從分子和細胞層面上進一步進行基因測序、基因表達分析、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、細胞免疫染色及細胞培養(yǎng)等[21-22]。

2.3 CTCs在肺癌靶向治療中的應用 隨著精準醫(yī)學的發(fā)展,NSCLC尤其是肺腺癌患者在治療前均需對EGFR及ALK基因的狀態(tài)進行檢測,從而為后續(xù)的靶向治療提供指導。目前多項研究證實,通過CTCs來檢測EGFR、ALK的突變狀態(tài)和通過腫瘤組織檢測具有很高的一致性。有研究證明在組織與外周血CTCs中EGFR檢測率的一致性高達84%[23];另一項研究通過FISH方法檢測CTCs中ALK融合基因的表達情況,研究共檢測了32例晚期肺癌患者,在18例組織學檢測為陽性的患者中,通過CTCs檢測,ALK基因均為陽性,14例組織學檢測為陰性的患者,通過CTCs檢測ALK陽性細胞表達≤1個,并且CTCs中ALK陽性細胞數可用于評估克唑替尼治療的效果[12]。Pailler等[24]在NSCLC患者中使用微流控裝置,應用等位基因特異性聚合酶鏈式反應進行EGFR突變擴增,在CTCs中檢測到L858R、del 19和T790M突變;研究還發(fā)現T790M CTCs陽性患者的無進展生存期為7.7個月,而最初T790M陰性患者的無進展生存期為16.5個月;另外通過對CTCs的序列進行分析顯示,CTCs的增加與腫瘤的進展有關,在某些情況下還與新的EGFR突變出現有關。Aieta等[25]觀察1例NSCLC患者CTCs中EML-ALK水平,發(fā)現經過成功的克唑替尼治療后,CTCs降低。Ilie等[26]對87例肺腺癌患者進行ALK FISH分析,5例組織活檢和CTCs分析均為陽性。這些研究證實了CTCs檢測可以指導肺癌的治療,監(jiān)測治療耐藥性的出現,并可用來預測晚期肺腺癌患者的生存期。2016年的一項研究發(fā)現基于CTCs的PD-L1檢測對于免疫檢查點抑制劑藥物PD-1/PD-L1的臨床用藥具有指導作用,此研究將應用PD-1/PD-L1抑制劑治療的24例Ⅳ期NSCLC患者的CTCs數目和CTCs上的PD-L1表達進行檢測和分析,發(fā)現在基線和治療3個月時,CTCs及其PD-L1的表達與患者的不良反應結果相關;治療后6個月,所有患者血液中都發(fā)現CTCs,其中PD-L1陰性CTCs的患者都獲得較好的治療效果,而PD-L1陽性CTCs的患者則出現了疾病進展[27]。由此可看出通過檢測CTCs的PD-L1可成為抗PD-1治療的預測性生物標志物。

3 TEXs

3.1 TEXs的概述 外泌體是由活細胞分泌的具有脂質雙層膜結構、直徑40～100 nm的微小囊泡,是通過“內吞-融合-外排”等一系列調控過程后而形成的胞外納米級多泡體[28-30]。膜內主要包含有蛋白質、核酸和脂質。TEXs主要包含miRNA和蛋白質,它通過與腫瘤微環(huán)境中的其他細胞相互作用來調節(jié)腫瘤進展、血管形成平衡、轉移和免疫逃逸。Thakur等[29]研究發(fā)現,TEXs攜帶dsDNA,并且其DNA可以反映親代腫瘤細胞的突變狀態(tài)。研究表明TEXs可能是肺癌“液體活檢”的生物標志物,TEXs能影響腫瘤微環(huán)境的形成、增強腫瘤細胞侵襲與轉移能力、介導腫瘤免疫抑制及參與腫瘤放化療抵抗進而促進腫瘤發(fā)生與發(fā)展[30-32]。因此,TEXs可作為生物標志物對腫瘤的診斷及預后預測提供一定的價值。另外,TEXs含有多種不同的免疫刺激和免疫抑制因子,這些因子支持受體細胞的重新編程,穿梭在信號分子和腫瘤抗原中,在細胞-細胞通訊中發(fā)揮重要作用。TEXs的外膜由鞘磷脂組成,這樣能保證外泌體的內含物在體液中穩(wěn)定存在。因此,針對TEXs的液態(tài)活檢將為疾病的精準醫(yī)療、個體化治療提供更好的研究價值。

3.2 TEXs的檢測方法 TEXs的檢測包括分離純化及表征驗證,科研工作者最關注的問題是分離純化,高純度的TEXs是保證后續(xù)研究成功的關鍵。目前TEXs分離提取的方法主要有超速離心法、蔗糖梯度離心法、密度梯度離心法、超濾離心法、磁珠免疫法、PEG-base沉底法及試劑盒提取等。超離法操作簡單,且獲得的囊泡數量較多,成為了研究者最常用的TEXs分離純化的手段,但超速離心僅能富集TEXs或囊泡的亞型,不能起到純化的作用。TEXs提取純化后,在進行臨床應用前一般都需要對其進行表征驗證。目前表征驗證的方法主要有兩種,一種是形態(tài)學觀察,即通過電鏡進行觀察,可直觀了解和掌握TEXs的大小、形態(tài)等表觀信息[33-35]。另外一種是從分子蛋白水平進行驗證,它主要是采用Western blotting方法來檢測TEXs的表面標志蛋白質,如CD9、CD63等,與形態(tài)學判斷比較此方法更為精準。此外,還有一些其他方法,如動態(tài)光散射技術、流式細胞技術、納米微粒追蹤分析術等[32-33]。流式細胞技術和納米微粒追蹤分析技術主要是通過熒光信號的傳導進行測定,具有很高的分辨率和準確度,并且能進行定量和定性分析,但由于檢測成本較高,目前在臨床中還未能廣泛應用。

3.3 TEXs在肺癌靶向治療中的應用 大量研究表明TEXs可能是肺癌液態(tài)活檢的生物標志物,它的靈敏度和特異度比傳統的活檢方法更高。研究人員檢測了肺癌TEXs的標志物,如蛋白質和非編碼RNA[34]。Sandfeld-Paulsen等[35]對276例NSCLC患者進行了TEXs檢測,并評估了附在體膜上的49種蛋白質,結果顯示50%的患者存在食管鱗狀細胞癌抗原(new york-esop hageal-1,NY-ESO-1)增高,其是一種非常特異的預后生物標志物。肺癌患者中有兩種腫瘤抑制相關miRNA(miRNA-373、miRNA-512),它在激活狀態(tài)下對腫瘤的生長和侵襲具有抑制作用,研究表明這兩種miRNAs水平的下調與NSCLC患者的不良預后相關[36]。通過對肺癌細胞分泌的細胞外囊泡分析發(fā)現,TEXs表面高表達CD317和EGFR等,這些分子均可作為診斷NSCLC的可靠生物學標志[34-36]。在臨床應用方面,Exosome Diagnostics公司研發(fā)的基于血漿TEXs的ExoDx Lung(ALK)診斷試劑盒在2016年初已被美國FDA批準應用于臨床。這是全球第一個以血液樣本分析TEXs RNA的臨床液態(tài)活檢試劑盒,其能夠準確、靈敏、實時地檢測NSCLC患者的EML4-ALK突變情況。通過對腫瘤患者組織及血漿檢測ALK的表達水平,發(fā)現該項檢測可以達到88%的診斷靈敏度和100%的特異度。Krug等[37]用NGS方法分析54例NSCLC患者的EGFR激活突變和T790M突變,結果示通過外泌體ES和ctDNA檢測EGFR活化突變與組織活檢結果的符合率為96%,T790M突變符合率為86%。這些結果表明,ES分析在肺癌診斷中具有一定的應用價值,TEXs可作為肺癌潛在的治療靶點,且由于肺癌TEXs成分和功能的多樣性,可以為肺癌的治療提供多個潛在的治療靶點,如黑色素瘤相關基因(mda-9/syntenin)過表達可以促進小細胞肺癌釋放TEXs,通過以黑色素瘤相關蛋白為靶點設計的新藥可能為肺癌的治療帶來新方法。Yang等[38]也發(fā)現促進TEXs中l(wèi)et-7的表達是肺癌治療的潛在靶點。Rolfo等[39]在研究NSCLC患者和正常人血清中TEXs時發(fā)現miR-30b和miR-30c水平升高與EGFR信號傳導通路相關,可進一步用來指導靶向藥物治療的敏感性,同時miR-221-3p和miR-222-3p過度表達的患者都與其EGFR突變狀態(tài)有關,在應用AZD9291治療的過程中都取得了良好的效果。另外,Jung等[40]通過蛋白質組學分析發(fā)現肺癌細胞分泌的TEXs中多種蛋白質成分和磷脂成分參與吉非替尼的耐藥性,提示TEXs參與了肺癌靶向藥物耐藥的發(fā)生。

腫瘤細胞還能通過TEXs調節(jié)腫瘤免疫。主要是通過攜帶免疫抑制因子并抑制免疫細胞(如樹突狀細胞、NK細胞、CD4+和CD8+T淋巴細胞)發(fā)揮的抗腫瘤免疫效應,誘導免疫抑制和調節(jié)細胞群,如髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)、調節(jié)性T細胞(Tregs)、調節(jié)性B細胞(Bregs)等,而MDSCs具有抑制T細胞免疫應答的能力。最新肺癌免疫治療方法之一依賴于阻斷T細胞活化的負調節(jié)物,如PD-1和PD-L1以及腫瘤微環(huán)境中的炎性信號[41]。另一方面,TEXs可以調節(jié)腫瘤微環(huán)境內的抗炎信號,這可以有效增強肺癌免疫治療效果。因此,圍繞肺癌TEXs的治療研究將為探索肺癌個體化、精準化治療策略提供新的思路。

4 展望

液態(tài)活檢具有無侵入性、可頻繁多次檢測及快速反映機體變化等優(yōu)勢,具有廣泛的應用前景及廣闊的發(fā)展空間。它不僅可以指導肺癌的分子靶向治療及治療過程中的耐藥監(jiān)測;還可以指導肺癌的免疫靶向治療。然而,現階段液態(tài)活檢還不能夠取代組織活檢的金標準地位。液態(tài)活檢所提供的信息還需要更先進的技術來做出更深層次的解讀。與傳統的腫瘤檢測方法相比,液態(tài)活檢是一個不斷發(fā)展的概念,隨著時間推移,其外延也在不斷擴展。從廣為人知的血液檢測到現在的尿液、唾液檢測;從蛋白類腫瘤標志物檢測,到如今的CTC、ctDNA,再到最近幾年興起的TEXs。液體活檢始終是一個試驗性、探索性的課題。將來隨著檢測方法的不斷進步,液態(tài)活檢技術一定能真正用于臨床指導肺癌的精準治療,發(fā)揮更大的作用。