納米ZnO對(duì)1株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌Halomonas sp. KGL1的生物脅迫效應(yīng)研究?

康兆顏， 白 潔,2， 郭曉旭， 陳 琳， 胡春輝， 李巋然

(1.中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100； 2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100； 3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；4.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

納米技術(shù)的迅速發(fā)展引起眾多領(lǐng)域發(fā)生革命性變化，隨著納米產(chǎn)品種類和數(shù)量的逐年遞增，釋放到環(huán)境中的納米材料量也逐漸增多，嚴(yán)重威脅生態(tài)環(huán)境和人類健康，因此納米材料的安全性近年來(lái)受到國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注[1]。ZnO-NPs因其同時(shí)具有納米材料和傳統(tǒng)氧化鋅材料的雙重特性，在紡織工業(yè)、化妝品、工業(yè)涂層、醫(yī)學(xué)抗菌和水處理等領(lǐng)域中被廣泛的應(yīng)用[2-4]，導(dǎo)致其被加速釋放到水環(huán)境中。由于納米材料具有顆粒小、表面積大的特點(diǎn)，與其他材料相比具有更大的表面活性和遷移性能，因此其毒性與常規(guī)尺寸的物質(zhì)不同或毒性效應(yīng)更大[5]，且ZnO-NPs比其他金屬氧化物納米顆粒(如TiO2、SiO2、CuO等)的毒性更大[6-7]。

海洋作為各種污染物質(zhì)的最終歸趨地，納米材料將不可避免地通過(guò)各種途徑進(jìn)入海洋環(huán)境，人類利用海水進(jìn)行水產(chǎn)品養(yǎng)殖等活動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的高鹽含氮廢水中也會(huì)含有納米材料。據(jù)報(bào)道，ZnO-NPs被頻繁檢測(cè)到存在于污水處理系統(tǒng)中[8-9]，自然水體中ZnO-NPs顆粒的總量在1～100 μg·L-1之間，但由于污水處理系統(tǒng)的過(guò)濾、沉淀功能以及納米顆粒易吸附在生物活性污泥表面等性質(zhì)，導(dǎo)致污水處理系統(tǒng)中納米顆粒濃度累積達(dá)到mg·L-1的水平[10]。納米顆粒的累積會(huì)影響海水養(yǎng)殖污水處理系統(tǒng)中脫氮細(xì)菌的正常生長(zhǎng)代謝，從而導(dǎo)致水處理生物脫氮效率下降，影響海水養(yǎng)殖廢水的循環(huán)利用及排放，最終會(huì)對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)造成危害[9]，其中河口地區(qū)污染尤為嚴(yán)重[11]。

1 材料與方法

1.1 ZnO-NPs的表征及懸濁液制備

本研究中ZnO-NPs購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，純度>99.7%，直接取樣用于觀察表征ZnO-NPs的形態(tài)；為制備懸濁液，取500 mg ZnO-NPs分散于100 mL經(jīng)高溫滅菌的去離子水中，使用前室溫下超聲3 h，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 菌株來(lái)源及培養(yǎng)基

微量元素溶液(g·L-1)：Na2EDTA 63.70；CaCl25.50；ZnSO42.20；MnCl2·4H2O 5.06；FeSO4·7H2O 5.0；CoCl2·6H2O 1.61；Na2MoO4·4H2O 1.10；CuSO4·5H2O 1.57。

1.3 ZnO-NPs對(duì)Halomonas sp. KGL1的短期暴露實(shí)驗(yàn)

1.4 測(cè)定方法

LDH使用南京建成生物公司的LDH試劑盒來(lái)檢測(cè)，取適量菌液1 000 r·min-1離心5 min，取上清液并逐步添加試劑后，使用酶標(biāo)儀(Multiskan Spectrum)在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品。

ROS使用南京建成生物公司的活性氧試劑盒來(lái)檢測(cè)，取適量菌液加入適量的ROS探針DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)，在細(xì)菌培養(yǎng)相同條件下培養(yǎng)30 min 后，1 000 r·min-1離心10 min收集菌體，用pH為7.4的PBS緩沖液洗滌菌體2次，使用流式細(xì)胞儀(AccuriTM C6 Plus Flow Cytometer)在最佳激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、最佳發(fā)射波長(zhǎng)525 nm下進(jìn)行樣品測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)差異性分析，當(dāng)P<0.05時(shí)表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZnO-NPs的形態(tài)表征

經(jīng)透射電子顯微鏡掃描分析顯示(見(jiàn)圖1)，ZnO-NPs顆粒形態(tài)呈不規(guī)則桿狀，粒徑較不均勻，但粒徑均低于100 nm，有研究發(fā)現(xiàn)[25-27]，顆粒尺寸會(huì)影響ZnO-NPs的毒性，尺寸越小，比表面積越大，暴露于顆粒表面的活性位點(diǎn)越多，顆粒的表面活性越強(qiáng)，ZnO-NPs的毒性也越強(qiáng)；其顆粒間存在不同程度的團(tuán)聚，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用ZnO-NPs時(shí)，都使用超聲分散儀進(jìn)行分散，以有效緩解其團(tuán)聚現(xiàn)象。

2.2 不同濃度ZnO-NPs對(duì)Halomonas sp. KGL1形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)菌表面一般帶有負(fù)電荷，帶正電荷的ZnO-NPs和細(xì)菌間可能產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電引力，使其更容易吸附到細(xì)菌表面，直接與細(xì)菌接觸[28]。納米顆粒吸附在細(xì)菌表面會(huì)磨損細(xì)胞壁、損傷細(xì)胞膜，同時(shí)由于ZnO-NPs顆粒體積微小，可能堵塞細(xì)菌細(xì)胞膜上的各種運(yùn)輸通道，導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性增加，引起細(xì)菌細(xì)胞破裂等，一部分ZnO-NPs顆粒還可能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[29]，進(jìn)一步造成菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷。

圖1 ZnO-NPs透射電鏡圖Fig.1 TEM image of ZnO-NPs

菌株Halomonassp. KGL1在不同濃度ZnO-NPs暴露24 h后的形態(tài)如圖2所示，對(duì)照組菌體為短桿狀且形態(tài)飽滿分散(見(jiàn)圖2(a))，隨著ZnO-NPs濃度的升高，菌體發(fā)生不同程度的團(tuán)聚和損傷。ZnO-NPs濃度為1 mg·L-1時(shí)菌體表面即開(kāi)始出現(xiàn)粘連現(xiàn)象，發(fā)生小規(guī)模團(tuán)聚，但沒(méi)有明顯的損傷產(chǎn)生(見(jiàn)圖2(b))。隨著ZnO-NPs濃度升高到10和50 mg·L-1時(shí)，菌體出現(xiàn)大規(guī)模團(tuán)聚和粘連現(xiàn)象，菌體開(kāi)始出現(xiàn)損傷，濃度為10 mg·L-1時(shí)少部分菌體發(fā)生凹陷(見(jiàn)圖2(c))，濃度為50 mg·L-1時(shí)菌體損傷嚴(yán)重，較多的菌體出現(xiàn)凹陷和破碎現(xiàn)象(見(jiàn)圖2(d))。結(jié)果表明ZnO-NPs濃度越高，對(duì)該菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響越顯著。有研究通過(guò)透射電子顯微鏡觀察到ZnO-NPs可導(dǎo)致污水生物處理系統(tǒng)中的典型氨氧化菌Nitrosomonaseuropaea(N.europaea)的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變、細(xì)胞膜受到損傷，并呈現(xiàn)顯著的濃度抑制效應(yīng)[20-21,30]，其結(jié)果與本研究相似。

2.3 不同濃度ZnO-NPs對(duì)Halomonas sp. KGL1細(xì)胞膜完整性的影響

細(xì)胞膜作為細(xì)胞接觸外界的第一道屏障，可以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的代謝環(huán)境，同時(shí)調(diào)節(jié)和選擇進(jìn)出細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。LDH是一種細(xì)胞溶質(zhì)酶，在正常情況下，不能透過(guò)細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞膜發(fā)生損傷時(shí)，LDH即會(huì)釋放到細(xì)胞外，因此可以通過(guò)對(duì)LDH釋放率的分析推測(cè)出菌株Halomonassp. KGL1細(xì)胞膜的完整性[31]。

以對(duì)照組LDH釋放率為100%，計(jì)算該菌株在不同濃度ZnO-NPs暴露24 h后LDH的釋放率。如圖3所示，隨ZnO-NPs濃度的增加，LDH釋放率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)ZnO-NPs濃度為1和10 mg·L-1時(shí)，LDH釋放率分別為118%和136%，在這兩種濃度下ZnO-NPs對(duì)菌株細(xì)胞膜完整性無(wú)顯著影響(P>0.05)；當(dāng)ZnO-NPs濃度為50 mg·L-1時(shí)，LDH釋放率為372%，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，表明該菌株在此暴露濃度下細(xì)胞膜完整性受到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，與掃描電鏡(見(jiàn)圖2(d))的結(jié)果一致。已有研究發(fā)現(xiàn)8 mg·L-1的ZnO-NPs會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生LDH，并且使細(xì)胞膜滲透性明顯増強(qiáng)[32]，與之相比，本研究中菌株相對(duì)更加敏感，1 mg·L-1的ZnO-NPs即會(huì)導(dǎo)致該菌株的細(xì)胞產(chǎn)生LDH，改變菌株細(xì)胞膜的粘滯性。

((a)0 mg ·L-1；(b)1 mg ·L-1；(c)10 mg ·L-1；(d)50 mg ·L-1)

圖2 ZnO-NPs對(duì)Halomonassp. KGL1形態(tài)的影響
Fig.2 Impacts of ZnO-NPs on morphology ofHalomonassp. KGL1

(*表示與對(duì)照組相比，兩組間差異顯著，下同。* indicates that there is a significant difference between the two groups compared with the control group, the same below.)

圖3 ZnO-NPs對(duì)LDH釋放的影響
Fig.3 Impacts of ZnO-NPs on LDH production

2.4 不同濃度ZnO-NPs對(duì)Halomonas sp. KGL1活性氧的影響

ROS是一類含氧活性分子的總稱，主要有3種類型：超氧陰離子(O2-)，過(guò)氧化氫(H2O2)以及羥自由基(·OH)，細(xì)菌體內(nèi)代謝過(guò)程會(huì)產(chǎn)生少量ROS，在外源環(huán)境的脅迫下則會(huì)產(chǎn)生過(guò)多ROS[33]。

以對(duì)照組中ROS產(chǎn)生率為1，研究菌株Halomonassp. KGL1在不同濃度ZnO-NPs暴露24 h后ROS的產(chǎn)生情況(見(jiàn)圖4)。ZnO-NPs脅迫會(huì)使該菌株細(xì)胞產(chǎn)生ROS，且隨ZnO-NPs濃度的增加，ROS產(chǎn)生量越高。當(dāng)ZnO-NPs濃度為1和10 mg·L-1時(shí)，檢測(cè)到ROS含量分別為對(duì)照組的1.11和1.27倍(P>0.05)，且菌株細(xì)胞膜未發(fā)生顯著損傷，表明在這兩種濃度下ZnO-NPs未誘導(dǎo)菌株細(xì)胞發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激效應(yīng)；當(dāng)ZnO-NPs濃度為50 mg·L-1時(shí)，檢測(cè)到ROS含量為對(duì)照組的2.76倍(P<0.05)，ROS產(chǎn)生量顯著增大，在此濃度下菌株細(xì)胞氧化應(yīng)激效應(yīng)顯著，從而導(dǎo)致菌體嚴(yán)重?fù)p傷(見(jiàn)圖2(d))，產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能與細(xì)胞膜被破壞(見(jiàn)圖3)導(dǎo)致ZnO-NPs進(jìn)入菌株細(xì)胞有關(guān)。結(jié)果表明ZnO-NPs對(duì)該菌株的生物脅迫效應(yīng)除直接作用于菌株表面外，也與菌株細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化密切相關(guān)。

圖4 ZnO-NPs對(duì)ROS釋放的影響Fig.4 Impacts of ZnO-NPs on ROS production

2.5 不同濃度ZnO-NPs對(duì)Halomonas sp. KGL1生長(zhǎng)的影響

菌株細(xì)胞損傷會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)，不同濃度ZnO-NPs對(duì)菌株Halomonassp. KGL1生長(zhǎng)的影響如圖5所示。菌株在不同濃度ZnO-NPs暴露初期OD600值的變化趨勢(shì)一致，但暴露8 h后不同濃度組的菌株生長(zhǎng)速率開(kāi)始出現(xiàn)差異，ZnO-NPs濃度越高，菌株生長(zhǎng)速率越慢，OD600值越低。當(dāng)ZnO-NPs濃度為1 mg·L-1時(shí)，菌株的OD600值變化趨勢(shì)較對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)；當(dāng)菌株在ZnO-NPs濃度為10、50 mg·L-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，OD600值分別為1.82和1.36，分別較對(duì)照降低19%和43%(P<0.05)，生長(zhǎng)速率受到顯著抑制。由此可見(jiàn)，ZnO-NPs濃度越高，對(duì)該菌株生長(zhǎng)的抑制程度越強(qiáng)，產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能與高濃度ZnO-NPs導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞并產(chǎn)生大量ROS有關(guān)。

2.6 不同濃度ZnO-NPs對(duì)Halomonas sp. KGL1脫氮能力的影響

圖5 ZnO-NPs對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.5 Impacts of ZnO-NPs on growth of Halomonas sp. KGL1

圖6 ZnO-NPs對(duì)去除率的影響Fig.6 Impacts of ZnO-NPs on removal efficiency of

圖7 ZnO-NPs對(duì)去除率的影響Fig.7 Impacts of ZnO-NPs on

圖8 ZnO-NPs對(duì)累積量的影響Fig.8 Impacts of ZnO-NPs on accumulation amount of

3 討論

目前關(guān)于納米材料對(duì)細(xì)菌毒性機(jī)制的研究主要集中在細(xì)胞膜損傷和氧化脅迫兩個(gè)方面[21]，其中ROS的產(chǎn)生等對(duì)生物體的氧化脅迫目前被認(rèn)為是導(dǎo)致納米材料生物脅迫效應(yīng)的主要方式[34-36]。ZnO-NPs等納米材料可與細(xì)菌細(xì)胞直接接觸，并吸附在細(xì)菌細(xì)胞膜表面[12]，進(jìn)而改變細(xì)胞膜粘滯性和細(xì)胞膜滲透性，此外，ROS的產(chǎn)生也可能會(huì)損傷細(xì)菌細(xì)胞膜[37-39]，細(xì)胞膜的損傷導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變并且損傷細(xì)胞功能，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[40-41]。本研究通過(guò)掃描電鏡的觀察研究以及對(duì)LDH的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，ZnO-NPs會(huì)破壞菌株Halomonassp. KGL1的細(xì)胞膜，改變菌株細(xì)胞膜粘滯性，從而導(dǎo)致菌株細(xì)胞發(fā)生團(tuán)聚，菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其中50 mg·L-1的ZnO-NPs對(duì)菌株細(xì)胞影響最為顯著。細(xì)胞膜被破壞可能導(dǎo)致ZnO-NPs進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞誘導(dǎo)其發(fā)生氧化應(yīng)激效應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡造成細(xì)胞內(nèi)ROS累積[42]，過(guò)量ROS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等分子過(guò)度氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)引起機(jī)體一系列代謝反應(yīng)的失常和免疫功能降低，損害生物膜及其功能，對(duì)細(xì)胞造成進(jìn)一步損傷[32]。已有研究者[15,21-22,34,37]發(fā)現(xiàn)ZnO-NPs導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜完整性被破壞、細(xì)菌濃度、脫氮速率降低的原因可能與ZnO-NPs誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS大量產(chǎn)生密切相關(guān)。本研究中，ZnO-NPs能夠誘導(dǎo)菌株Halomonassp. KGL1細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激效應(yīng)產(chǎn)生ROS，且ROS的產(chǎn)生量與ZnO-NPs濃度呈正相關(guān)關(guān)系，50 mg·L-1的ZnO-NPs誘導(dǎo)菌株細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，并且在該濃度下菌株生長(zhǎng)和脫氮過(guò)程受脅迫程度最強(qiáng)。

綜上所述，當(dāng)海水養(yǎng)殖污水處理系統(tǒng)中ZnO-NPs濃度低于10 mg·L-1時(shí)，菌株Halomonassp. KGL1在該環(huán)境中受脅迫程度較小，其在處理此類高鹽含氮廢水時(shí)仍可以發(fā)揮高效的脫氮能力，并且當(dāng)ZnO-NPs濃度低于1 mg·L-1時(shí)，對(duì)菌株Halomonassp. KGL1的影響是可以忽略不計(jì)的。鑒于納米材料應(yīng)用的日趨廣泛性與潛在的安全性問(wèn)題, 不同納米材料對(duì)菌株Halomonassp. KGL1的生物脅迫效應(yīng)需要繼續(xù)探究。

4 結(jié)論

(1) ZnO-NPs對(duì)菌株Halomonassp. KGL1的生物脅迫除直接作用于菌體表面破壞菌株細(xì)胞細(xì)胞膜和形態(tài)結(jié)構(gòu)外，也與菌株細(xì)胞內(nèi)ROS水平密切相關(guān)。

(2) ZnO-NPs濃度為1 mg·L-1時(shí)對(duì)菌株Halomonassp. KGL1無(wú)顯著影響，濃度為50 mg·L-1時(shí)對(duì)菌株Halomonassp. KGL1抑制作用顯著，各生物脅迫效應(yīng)強(qiáng)度均隨ZnO-NPs濃度的升高而增大。