人血漿中雷貝拉唑與氯吡格雷測定方法及存在的問題

倪一帆

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310000）

1.國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

氯吡格雷是一種噻吩并吡啶類衍生物，其作用機(jī)制是可以抑制二磷酸腺苷（ADP）與血小板受體P2Y12結(jié)合，使纖維蛋白原無法與糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合[1]，實現(xiàn)抗血小板聚集作用及抗血小板形成的作用。現(xiàn)在應(yīng)用于動脈粥樣硬化患者的預(yù)防腦卒中、心肌梗死等急性缺血事件的發(fā)生。通常氯吡格雷和阿司匹林的聯(lián)合使用，比在急性冠脈綜合征患者單獨使用阿司匹林有顯著減少死亡率、非致命性心梗死、中風(fēng)等的風(fēng)險。

氯吡格雷和阿司匹林的治療降低了急性冠脈綜合征的復(fù)發(fā)率，但是經(jīng)常引起消化道的出血、消化不良等不良反應(yīng)。為了減少不良反應(yīng)，質(zhì)子泵抑制劑（雷貝拉唑）被應(yīng)用在氯吡格雷和阿司匹林的治療中，來減少消化道出血的風(fēng)險。雷貝拉唑是一種抑制分泌的藥物，無抗膽堿和抗H兩組胺特性，可以在胃壁細(xì)胞表面通過抑制H+/K+-ATP酶活性[1]，阻斷胃酸分泌的最后環(huán)節(jié),抑制胃酸的分泌，從而產(chǎn)生抑制氯吡格雷的不良反應(yīng)。

但是，一些報道中提到氯吡格雷和雷貝拉唑可能在人體內(nèi)發(fā)生互相作用，而使氯吡格雷的抗血小板聚集作用降低。

為了證明這一現(xiàn)象，研究者們研究了氯吡格雷在體內(nèi)代謝的過程。氯吡格雷是一種前藥，它被吸收到體內(nèi)后有85%通過水解酯酶水解生成沒有活性的羧酸鹽衍生物，還有一小部分母體化合物通過肝臟生物轉(zhuǎn)換的氧化作用后形成2-氧基-氯吡格雷，主要由細(xì)胞色素P450同功酶2B6和3A4調(diào)節(jié)。再經(jīng)過水解反應(yīng)形成活性代謝物，一種硫醇衍生物。而雷貝拉唑也可以通過肝藥酶途徑代謝，通過競爭抑制CYP2C19和CYP3A4同工酶來降低氯吡格雷的臨床作用[5-6]。

從臨床回顧性研究中來看，氯吡格雷和雷貝拉唑有互相作用?，F(xiàn)有的臨床回顧性研究尚存在一定的局限性：（1）和對照組相比,使用雷貝拉唑的患者往往有更多并發(fā)癥,比如腎功能不全,糖尿病等,這些因素可能使血小板的聚集程度加劇,也是影響氯吡格雷發(fā)揮治療效果的主要因素；（2）其他一些影響心血管疾病轉(zhuǎn)歸的因素,如吸煙、非處方類PPI 的使用情況等并未在現(xiàn)有的研究中列出[3]。

目前尚缺少兩者相互作用的直接證據(jù)，即藥代動力學(xué)相互作用研究。

2.測定方法

為了可以更好的觀察氯吡格雷和雷貝拉唑有的互相作用是否存在，需要開展氯吡格雷和雷貝拉唑相互作用的人體藥代動力學(xué)研究。人體血漿中氯吡格雷及代謝產(chǎn)物或單獨測定雷貝拉唑方法均已有文獻(xiàn)報道：

2.1 氯吡格雷及其代謝產(chǎn)物在血漿中含量的測定方法

2.1.1 氯吡格雷在人血漿濃度的液質(zhì)聯(lián)用測定法[7-9]

由劉淼[9]，等研究者發(fā)表在中國臨床藥理學(xué)雜志，液質(zhì)聯(lián)用測定法測定人血漿中的氯吡格雷濃度。該法血漿預(yù)處理用0.5ml血漿，使用叔丁基甲醚進(jìn)行液-液提取。流動相為乙腈-水（含有10mmol/L的醋酸銨，調(diào)節(jié)pH為4.0）（70:30）。使用正離子檢測，掃描方式是多反應(yīng)監(jiān)測，測定化合物的母離子和子離子。靈敏度為10pg/ml。

結(jié)果為氯吡格雷的線性范圍為10～12000pg/ml，最低定量濃度為10pg/ml。

本方法優(yōu)點：使用液質(zhì)聯(lián)用方法，可以增加檢測的靈敏度；使用叔丁基甲醚液液提取方法，提取效果好、操作簡單減少了誤差和雜質(zhì)的影響；流動相選擇乙腈-水體系使出峰時間提前。可適用于血藥濃度監(jiān)測、群體藥代動力學(xué)/藥效學(xué)和臨床個體化給藥的研究。

2.1.2 RP-HPLC法測定人血清中氯吡格雷濃度的方法

由王夏芹[10]，等研究者在安徽醫(yī)藥期刊上發(fā)表，使用反相高效液相色潽法測定人血清中氯吡格雷的含量。樣品預(yù)處理方法是取0.5ml血清，分別使用二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯：二氯甲烷(80：20)液-液提取法。使用流動相為磷酸二氫鉀溶液-甲醇（使用磷酸調(diào)pH至3）（35:65）。使用紫外檢測器，檢測波長為235nm。

結(jié)果為氯吡格雷的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.625～4.0mg/L,最低定量濃度為0.0625mg/L，取對照品溶液經(jīng)水稀釋后，按信噪比大于5的要求，結(jié)果本品最低檢測限為0.00313mg/L。提取回收率、方法回收率、日內(nèi)日間RSD、準(zhǔn)確度等標(biāo)準(zhǔn)符合SFDA的相關(guān)要求。

使用流動相磷酸二氫鉀溶液-甲醇為35:65，可以是氯吡格雷的保留時間在14.5min左右，基本能滿足臨床上快速測定人血清中氯吡格雷濃度的要求。使用二氯甲烷提取效果比使用乙酸乙酯和乙酸乙酯：二氯甲烷(80:20)提取效果好，縮短了提取時間，減少了人工和延長了色譜柱的使用壽命。為檢測氯吡格雷的血藥濃度提供了簡單可行的方法，還可用于氯吡格雷藥物代謝動力學(xué)的研究。

2.1.3 LC-MS/MS法同時測定人血漿中氯吡格雷及其羧酸代謝物的濃度[11-12]

由樊宏偉[12]，等研究者發(fā)表在中國新藥與臨床雜志中。該方法可以同時測定血漿中氯吡格雷和其羧酸代謝物的濃度。血漿預(yù)處理的方法是取0.5ml血漿，使用乙醚：正己烷=4：1（v：v）2次液-液提取法（中性和酸化條件下），采用那格列酮和吡格列酮這兩種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。其流動相是甲醇-0.1%甲酸（80：20）。以多反應(yīng)離子監(jiān)測方式監(jiān)測母離子和子離子。

結(jié)果為氯吡格雷的線性范圍為5～5000ng/L，最低定量限為5ng/L；SR26334的線性范圍為20～2500ug/L，最低定量限為20ug/L。

優(yōu)點在于使用檢測方法為串聯(lián)質(zhì)譜，最低檢測限可以達(dá)到1ug/L以下，靈敏度高。使用乙醚：正己烷=4：1（v：v）2次液-液提取法可以提高氯吡格雷和SR26334的回收率。兩種內(nèi)標(biāo)在實際使用中可以選擇一種。該方法可用于氯吡格雷的新藥臨床研究,也可用于ACS病人及其他需長期治療的病人氯吡格雷及SR26334血藥濃度的常規(guī)的監(jiān)測。

2.2 雷貝拉唑含量在血漿中的測定

2.2.1 HPLC-MS法測定人血漿中雷貝拉唑的濃度及其藥動學(xué) 由王曉輝[13]等研究者在中國臨床藥學(xué)雜志上發(fā)表，建立人血漿中雷貝拉唑的HPLC-MS測定方法。血漿樣品預(yù)處理，取血漿500ul，使用乙酸乙酯進(jìn)行液-液提取。流動相使用乙腈-水（75：25）。使用質(zhì)譜檢測，采用正離子方式檢測。

結(jié)果為雷貝拉唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為20～1000ug/L，最低定量濃度為20ug/L。

實驗所用的方法優(yōu)點為專屬性強(qiáng)、簡便快速、重現(xiàn)性好、靈敏度高，適用于雷貝拉唑鈉腸溶片的體內(nèi)藥動學(xué)和生物等效性研究，為雷貝拉唑的臨床藥動學(xué)研究提供了一種新的分析方法。

2.2.2 高效液相色譜法測定血漿中雷貝拉唑的濃度 由扈本荃[14]，等研究者在中國藥學(xué)雜志上發(fā)表，建立高效液相色譜法測定血漿中雷貝拉唑的濃度。取血漿1.0ml，使用醋酸乙酯進(jìn)行液-液提取。流動相：0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（用0.1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7）一乙腈(69:31)。使用紫外檢測器，檢測波長為284nm。

結(jié)果為雷貝拉唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為5.46～2184.61ug/L，最低定量濃度為5.46ug/L。

流動相中使用緩沖鹽，可以使用出峰時間更為理想并且無血漿雜質(zhì)峰的干擾。但是缺點是使用鹽濃度過高，會影響柱子的壽命，而每次沖洗柱子時要花費更多的時間。而緩沖液的濃度會影響實驗方法的提取率。本法準(zhǔn)確、靈敏，適于雷貝拉唑藥動學(xué)研究。

3.存在問題

目前報道的方法中，大都為氯吡格雷的測定或者氯吡格雷以及其無活性羧酸代謝物的測定方法，對于氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物硫醇衍生物的報道很少見。氯吡格雷的硫醇衍生物是觀察兩者相互作用比較理想的指標(biāo)，但是氯吡格雷的硫醇衍生物在血漿中可能不穩(wěn)定而氯吡格雷硫醇衍生物又是氯吡格雷相互作用的關(guān)鍵指標(biāo)。此外，由于氯吡格雷和雷貝拉唑相互作用研究需要同時測定多種成分（包括氯吡格雷、代謝產(chǎn)物、雷貝拉唑），目前尚無方法可以同時測定，亟需建立一個同時測定氯吡格雷、氯吡格雷代謝產(chǎn)物和雷貝拉唑的方法，為氯吡格雷的相互作用研究提供支持。