骨肉瘤耐受順鉑的機(jī)制研究進(jìn)展

雍磊 劉曉光

作者單位：100191 北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科

骨肉瘤是臨床最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，好發(fā)于兒童及青少年。過去以手術(shù)為主的治療手段只能使患者5 年生存率維持在 20% 左右，從 20 世紀(jì) 70 年代開始，化療聯(lián)合手術(shù)的治療方案使患者的 5 年生存率達(dá)到 60%～70%[1]。然而，近 30 年來，骨肉瘤的治療效果沒有進(jìn)一步的提高，這其中一個(gè)重要原因是化療耐受的普遍發(fā)生[2]。因此明確化療耐受機(jī)制并尋找逆轉(zhuǎn)耐受的新策略成為改善骨肉瘤預(yù)后的當(dāng)務(wù)之急。

自 1978 年被批準(zhǔn)使用，順鉑已經(jīng)廣泛用于多種實(shí)體瘤如睪丸癌、卵巢癌、宮頸癌、頭頸癌及肺癌等的治療[3]。作為骨肉瘤四大經(jīng)典化療藥物 ( 阿霉素、大劑量甲氨蝶呤、順鉑和異環(huán)磷酰胺 ) 之一，順鉑發(fā)揮殺傷能力的基礎(chǔ)是與 DNA 結(jié)合，造成 DNA 損傷，但其療效被患者的遺傳性或獲得性耐藥能力大幅削弱，單獨(dú)應(yīng)用時(shí)僅在 30%患者中產(chǎn)生應(yīng)答[4]。與其它三種藥物不同，順鉑是惟一含金屬元素的藥物，這使順鉑在某些關(guān)鍵途徑與其它藥物無交叉耐藥性，所以單獨(dú)闡述骨肉瘤耐受順鉑的機(jī)制具有重要的治療價(jià)值。筆者將對(duì)骨肉瘤耐受順鉑的相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為逆轉(zhuǎn)順鉑耐受的探索提供更開闊的視角?，F(xiàn)報(bào)告如下。

一、細(xì)胞內(nèi)順鉑積累減少

腫瘤細(xì)胞內(nèi)順鉑積累的減少是導(dǎo)致耐受順鉑的重要原因[5-6]。研究顯示耐受順鉑的骨肉瘤細(xì)胞相對(duì)于其親代，胞內(nèi)順鉑積累量大幅降低 ( ＞50% )[7-8]。過去一直認(rèn)為順鉑僅通過被動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞，近年證實(shí)銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1( copper transporter 1，CTR1 ) 介導(dǎo)的主動(dòng)攝取是順鉑入胞的主要方式[9]。敲除釀酒酵母和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的CTR1 基因，二者順鉑積累分別減少 44% 和 70%，同時(shí)對(duì)順鉑的敏感性顯著降低[10]。在卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌中，CTR1 表達(dá)水平越低，腫瘤細(xì)胞中積累的鉑類藥物越少，患者對(duì)鉑類藥物的反應(yīng)越差[11-12]。但骨肉瘤耐受順鉑是否與 CTR1 低表達(dá)具有潛在關(guān)系尚未見報(bào)道，值得進(jìn)行探索。除了攝取減少，外排增加同樣降低順鉑的積累量。藥物泵出細(xì)胞的途徑多樣，骨肉瘤中的研究目前集中于 ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ( ATP-binding cassette transporters )。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族是一類具有 ATP 結(jié)合位點(diǎn)的蛋白，通過與 ATP 結(jié)合獲得能量，將多種藥物排出細(xì)胞，尤以多藥耐藥蛋白 1 ( multidrug resistance protein 1，MDR1，又稱為 P-糖蛋白 ) 及多藥耐藥相關(guān)蛋白 1 ( multidrug resistance-associated protein 1，MRP1 ) 活躍。MDR1 及MRP1 對(duì)于底物無選擇性，大量證據(jù)顯示二者高表達(dá)對(duì)骨肉瘤耐受阿霉素具有重要意義，抑制 MDR1 及 MRP1 均能增加骨肉瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，然而，卻不能實(shí)現(xiàn)對(duì)順鉑增敏[13-14]，這提示 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的外排作用可能不是影響骨肉瘤細(xì)胞中順鉑積累的關(guān)鍵因素，其作用尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，兩種銅轉(zhuǎn)運(yùn) P 型 ATP 酶( P-type ATPase ) ATP7A 及 ATP7B 也促進(jìn)順鉑耐受，它們能將順鉑隔離在細(xì)胞囊泡結(jié)構(gòu)中從而減少細(xì)胞內(nèi)的有效順鉑積累量或介導(dǎo)順鉑泵出細(xì)胞[15]。在耐受順鉑的腫瘤中，ATP7A 及 ATP7B 表達(dá)上調(diào)[16-17]；然而，骨肉瘤中也尚無關(guān)于 ATP7A 及 ATP7B 的研究。

二、細(xì)胞解毒能力增強(qiáng)

順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，胞內(nèi)低氯離子環(huán)境使順鉑的氯配體解離，同時(shí)鉑離子絡(luò)合水分子，形成帶正電的高活性水合分子。這種水合分子僅少部分與 DNA 結(jié)合，其余絕大部分被胞內(nèi)親核物質(zhì)結(jié)合而失去活性，其中最重要的親核物質(zhì)是谷胱甘肽 ( glutathione，GSH )[3]。早在 1998 年，Komiya 等[18]就在 8 株骨肉瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi) GSH 水平越高，順鉑的半數(shù)抑制濃度就越大；進(jìn)一步用丁硫氨酸-亞砜亞胺抑制 GSH 合成過程中的關(guān)鍵酶后，順鉑的殺傷效力明顯增強(qiáng)。GSH 與順鉑除了能直接結(jié)合外，還能在谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶 P1 ( glutathinoe S-transferase P1，GSTP1 )的催化下快速反應(yīng)，Huang 等[19]報(bào)道順鉑上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞 SaOS-2 和 HOS 中 GSTP1 的表達(dá)，在 SaOS-2 細(xì)胞中過表達(dá) GSTP1 后，細(xì)胞對(duì)順鉑的抵抗能力增強(qiáng)；相反，在HOS 細(xì)胞中干擾 GSTP1 的表達(dá)后，細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性上升。單核苷酸多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphisms，SNP ) 分析顯示骨肉瘤患者攜帶 GSTP1 rs1138272 與無瘤生存期和總生存期相關(guān)[20]。Pasello 等[21]在 34 例骨肉瘤患者中發(fā)現(xiàn) GSTP1 水平越高，腫瘤復(fù)發(fā)可能越大，患者無瘤生存期越短；進(jìn)一步將順鉑與 GSTP1 抑制劑序貫干預(yù)細(xì)胞，顯示出協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。

三、DNA 損傷修復(fù)或耐受增強(qiáng)

順鉑水合分子傾向于結(jié)合 DNA 嘌呤堿基的 N7 位點(diǎn)，形成順鉑-DNA 交聯(lián)物，其中絕大部分為鏈內(nèi)交聯(lián)，少部分為鏈間交聯(lián)。細(xì)胞若不能修復(fù)或耐受 DNA 損傷，就會(huì)啟動(dòng)下游凋亡途徑；反之，部分細(xì)胞能修復(fù)或耐受這些 DNA 損傷從而耐受順鉑。核苷酸切除修復(fù) ( nucleotide excision repair，NER ) 是修復(fù)鏈內(nèi)交聯(lián)的主要方式，其過程包括識(shí)別、切除、修復(fù)及接合。參與 NER 的蛋白眾多，其中促成順鉑耐受的關(guān)鍵因子包括切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因 1 ( excision repair cross-complementation group 1，ERCC1 )、著色性干皮病基因 F [ xeroderma pigmentosum( XP ) complementation group F，XPF ]、XPD 及 XPG。ERCC1 與 XPF 形成異源二聚體在 5' 端切除 DNA 損傷，研究顯示 ERCC1 的 SNP 與骨肉瘤患者的無瘤生存時(shí)間有關(guān)[22]，且 ERCC1 表達(dá)越高，患者無瘤生存期與總生存期越短[23]；在骨肉瘤細(xì)胞中用 shRNA 沉默 XPF 后，順鉑對(duì)細(xì)胞的殺傷效力顯著提高[24]。XPD 與 XPG 也參與損傷 DNA 的切除，骨肉瘤中二者的 SNP 也與患者的無瘤生存期相關(guān)[25]；且抑制 XPG 表達(dá)后，骨肉瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加[24]。錯(cuò)配修復(fù) ( mismatch repair，MMR ) 是在DNA 復(fù)制或重組過程中糾正錯(cuò)配堿基的方式，也是修復(fù)DNA 鏈內(nèi)損傷的一種方式，在骨肉瘤中，參與 MMR 的蛋白 MSH2 和 MSH6 高表達(dá)與化療不敏感相關(guān)[26]。另外，同源重組 ( homologous recombination，HR ) 能修復(fù)順鉑造成的鏈間交聯(lián)損傷，RAD51 蛋白參與 HR 途徑，研究顯示干擾 RAD51 能夠提高順鉑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的毒性作用[27]；新近發(fā)現(xiàn)范科尼貧血 ( fanconi anemia，F(xiàn)A ) 通路也能介導(dǎo)HR 修復(fù)，該通路被抑制后，骨肉瘤對(duì)順鉑的敏感性也增加[28]。除了修復(fù)能力增強(qiáng)，對(duì) DNA 損傷的耐受也能使細(xì)胞抵抗順鉑?？鐡p傷 DNA 合成 ( translesion DNA synthesis，TLS ) 是一種重要的 DNA 損傷耐受方式，它可以利用低保真性的聚合酶使細(xì)胞在 DNA 損傷存在的情況下，依然能夠繼續(xù)復(fù)制 DNA。在骨肉瘤細(xì)胞中，削弱 TLS途徑也能增強(qiáng)順鉑的殺傷效應(yīng)[28]。

四、凋亡信號(hào)通路減弱

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是順鉑-DNA 交聯(lián)物發(fā)揮細(xì)胞毒性的主要方式。所以，凋亡相關(guān)通路信號(hào)的抑制或缺失將會(huì)減弱順鉑的細(xì)胞毒性作用。參與凋亡的通路及蛋白多樣，如磷脂酰肌醇 3-激酶 / 絲氨酸或蘇氨酸激酶 ( PI3K / Akt )通路、p38 絲裂原活化蛋白激酶 ( mitogen-activated protein kinase，MAPK ) 通路、腫瘤抑制因子 p53 及抗凋亡蛋白等。腫瘤中 PI3K / Akt 通路能影響凋亡、增殖、分化等多方面表型，研究證實(shí)該通路的異常激活參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展[29]，同時(shí)，PI3K / Akt 通路也介導(dǎo)骨肉瘤耐受順鉑，抑制該通路能顯著增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[30-31]。作為MAPK 超家族的一員，p38 MAPK 通路是順鉑誘導(dǎo)的主要凋亡相關(guān)通路之一，該通路的抑制能夠使腫瘤耐受順鉑[32]。在骨肉瘤中，已經(jīng)證實(shí)外源激活 p38 MAPK 通路具有對(duì)順鉑增敏的效果[33]。p53 在藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中十分重要，但腫瘤中 p53 基因多發(fā)生突變，骨肉瘤中 p53 突變率高達(dá) 31%～82%，且大部分為功能喪失性突變[1]；在耐藥的骨肉瘤細(xì)胞系中，導(dǎo)入 p53 基因能顯著提高細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[34]?？沟蛲龅鞍妆磉_(dá)增加能抑制凋亡的發(fā)生，B 淋巴細(xì)胞瘤-2 ( B-cell lymphoma-2，Bcl-2 ) 蛋白家族是直接參與調(diào)控內(nèi)源性凋亡通路的關(guān)鍵蛋白，Bcl-2 及Bcl-xL 蛋白表達(dá)下調(diào)是啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡通路的關(guān)鍵信號(hào)。在化療耐受的腫瘤中，Bcl-2 普遍高表達(dá)[35]。在骨肉瘤中，Bcl-2 及 Bcl-xL 表達(dá)上調(diào)也使細(xì)胞耐受順鉑[36-37]。

五、自噬相關(guān)耐藥

自噬是自噬體與溶酶體共同介導(dǎo)的物質(zhì)降解過程，包括啟動(dòng)、囊泡成核、囊泡延伸、囊泡封閉、囊泡成熟、與溶酶體融合 6 個(gè)階段。雖然自噬與凋亡的關(guān)系存在爭(zhēng)議，但越來越多證據(jù)顯示自噬能幫助腫瘤細(xì)胞抵抗化療藥物引起的凋亡，使其獲得耐藥性[38]。Jiang 等[39]發(fā)現(xiàn)耐受順鉑的骨肉瘤細(xì)胞的自噬水平顯著升高。蛋白激酶 ULK1 復(fù)合物是自噬體形成的起點(diǎn)，正常情況下，ULK1 及 ATG13( ULK1 復(fù)合物的組成部分 ) 被哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 C1( mTORC1 ) 磷酸化而處于非活性態(tài)；饑餓時(shí)，mTORCT1去磷酸化，ULK1 得以活化，進(jìn)而啟動(dòng)后續(xù)自噬過程。研究顯示在骨肉瘤細(xì)胞中，順鉑能激活 SRC 激酶-AMP 依賴的蛋白激酶 ( AMPK ) 信號(hào)通路，活化的 AMPK 通路抑制 mTOR，從而誘導(dǎo)自噬；氯喹可以抑制自噬體與溶酶體的融合，體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示氯喹與順鉑聯(lián)合相對(duì)于順鉑單藥，抗骨肉瘤效果明顯增強(qiáng)[40]。III 型 PI3K ( PI3KC3 )-自噬相關(guān)蛋白 Beclin1 復(fù)合物參與囊泡成核。在骨肉瘤細(xì)胞中，順鉑通過上調(diào)高遷移率族蛋白 1 ( high mobility group box 1，HMGB1 ) 來促進(jìn) PI3KC3-Beclin1 復(fù)合體的形成，誘導(dǎo)自噬相關(guān)耐受[41]。

六、非編碼 RNA 相關(guān)耐藥

微小 RNA ( microRNA，miRNA ) 是一類長(zhǎng)度通常為18～25 個(gè)核苷酸的單鏈非編碼 RNA，它在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因 mRNA，從而發(fā)揮相應(yīng)作用。通過對(duì)比分析腫瘤 / 瘤旁組織或順鉑敏感 / 不敏感組織及細(xì)胞的 miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤中的以下改變均促進(jìn)對(duì)順鉑的耐受：miRNA-221[42]及 miRNA-33a[43]表達(dá)上升；miRNA-497[44]、 miRNA-138[45]、 miRNA-199a[46]、 miRNA-223[47]、miRNA-20a[48]、miRNA-22[49]、miRNA-34c[50]、miRNA-491[51]及 miRNA-340-5p[52]表達(dá)下降。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA ( long non-coding RNA，lncRNA ) 是長(zhǎng)度＞200 個(gè)核苷酸的非編碼 RNA，它能在基因、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后多個(gè)水平影響腫瘤的生物學(xué)行為。骨肉瘤中高表達(dá)的 lncRNA HOTTIP 激活 Wnt / β-catenin 通路，高表達(dá)的 lncRNA NEAT1 抑制 miRNA-34c，削弱順鉑的殺傷效應(yīng)[53-54]。lncRNA LINC00161 能通過上調(diào)干擾素誘導(dǎo)基因 2 ( IFIT2 )的表達(dá)來增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)凋亡的能力，在耐受順鉑的骨肉瘤細(xì)胞中，LINC00161 呈低表達(dá)[55]。與 miRNA 及 lncRNA 這些線性 RNA 不同，環(huán)狀 RNA ( circular RNA，circRNA ) 呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，近年研究顯示 circRNA 如 circPVT1[56]和circ_001569[57]也參與促進(jìn)骨肉瘤耐受順鉑。

七、腫瘤微環(huán)境相關(guān)耐藥

腫瘤微環(huán)境指腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的局部條件特征，包括細(xì)胞成分如免疫細(xì)胞及纖維細(xì)胞等及理化因素如溫度、pH值等。研究發(fā)現(xiàn)，在 42 ℃ 及 43 ℃，順鉑 ( 5 μg / ml ) 殺死骨肉瘤細(xì)胞的效率相對(duì) 37 ℃，分別提高 0.9 及 1.6 倍[58]。腫瘤局部的壓力變化也能影響細(xì)胞對(duì)順鉑的反應(yīng)，Nathan等將腫瘤切除術(shù)中監(jiān)測(cè)到的腫瘤組織液壓與 12 例骨肉瘤患者對(duì)包含順鉑在內(nèi)的化療方案的反應(yīng)好壞進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，好的預(yù)后與高的腫瘤組織液壓呈正相關(guān)；進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示高壓環(huán)境下，腫瘤增殖能力更強(qiáng)，從而對(duì)順鉑的反應(yīng)更敏感[59]。另外，有研究發(fā)現(xiàn) pH 降低時(shí) ( pH＝6.5 )，骨肉瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性也隨之降低[60]。實(shí)體瘤內(nèi)部通常呈現(xiàn)低氧狀態(tài)，大量證據(jù)表明低氧促進(jìn)對(duì)化療的耐受[61]。低氧同樣促進(jìn)骨肉瘤耐受順鉑，然而，與其它多數(shù)類型腫瘤不同，骨肉瘤中低氧介導(dǎo)的順鉑耐受是通過激活 PI3K / Akt 通路實(shí)現(xiàn)的，而不是抑制低氧誘導(dǎo)因子 1( hypoxia inducible factor-1，HIF-1 ) 的表達(dá)[62-63]。

八、腫瘤干細(xì)胞相關(guān)耐藥

腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為腫瘤起源于一小團(tuán)具有自我復(fù)制及分化能力的惡性細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞構(gòu)成整個(gè)腫瘤組織的一小部分，其相對(duì)于已分化的腫瘤細(xì)胞更加耐受化療[64]。從骨肉瘤細(xì)胞系中培育出的具有腫瘤干性特征的細(xì)胞對(duì)順鉑更加抵抗[65]。Notch 信號(hào)通路是維持腫瘤干細(xì)胞特征的關(guān)鍵因素[64]，Notch 通路抑制劑 DAPT 能減弱耐受順鉑的骨肉瘤細(xì)胞系的干性特征，并增加它們對(duì)順鉑的敏感性[66]。但骨肉瘤干細(xì)胞獲得順鉑抵抗的機(jī)制尚不清楚。Shang 等[67]檢測(cè)到 M2 型丙酮酸激酶 ( pyruvate kinase isoenzyme M2，PKM2 ) 在骨肉瘤干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，PKM2 能促進(jìn)三磷酸腺苷 ( ATP ) 的產(chǎn)生，提示能量供應(yīng)的增加可能與耐藥產(chǎn)生有關(guān)。

九、其它

失巢凋亡 ( anoikis ) 是細(xì)胞脫離其貼附的基質(zhì)后發(fā)生的程序性死亡，能防止細(xì)胞在不適宜的地方種植并生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞能通過某些途徑抵抗失巢凋亡，發(fā)生轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散。骨肉瘤細(xì)胞獲得抵抗失巢凋亡的能力后，對(duì)順鉑的耐受能力也增強(qiáng)了 1～6 倍[68]，提示二者可能具有一定關(guān)系。除了直接擴(kuò)散，細(xì)胞也能分泌外泌體與鄰近或遠(yuǎn)處細(xì)胞溝通。外泌體是 50～100 nm 大小的微囊泡，內(nèi)含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA 及豐富的 miRNA 等。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肺癌及胃癌中，外泌體通過運(yùn)輸特定 miRNA 使細(xì)胞耐受順鉑[69-71]。如前所述，多種 miRNA 能介導(dǎo)骨肉瘤耐受順鉑，那么在骨肉瘤中，外泌體是否參與傳遞相應(yīng)miRNA 的信息，從而促進(jìn)順鉑耐受，值得進(jìn)一步探究。

骨肉瘤的預(yù)后取得長(zhǎng)足改善始于化療藥物的應(yīng)用。而今多藥耐藥局面的出現(xiàn)，為臨床治療骨肉瘤提出巨大的挑戰(zhàn)。骨肉瘤耐受順鉑的機(jī)制多樣且復(fù)雜，目前已經(jīng)有一些研究針對(duì)這些耐藥機(jī)制來嘗試克服對(duì)順鉑的耐受，包括抑制細(xì)胞解毒能力[21]、抑制 DNA 損傷修復(fù)[28]、多藥聯(lián)合增強(qiáng)凋亡通路信號(hào)[33]等。需要注意的是，這些耐藥機(jī)制往往不是單一發(fā)揮作用，而是多途徑共同影響順鉑敏感性，這給降低骨肉瘤對(duì)順鉑耐受的探索帶來困難。近年來，免疫療法成為腫瘤治療的熱點(diǎn)，但骨肉瘤中的臨床試驗(yàn)效果都不令人滿意[72-73]。所以，對(duì)包括順鉑在內(nèi)的經(jīng)典化療藥物的耐受研究依然任重道遠(yuǎn)。相信隨著對(duì)順鉑耐藥機(jī)制理解的深入與透徹，將會(huì)產(chǎn)生有力可靠的逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的方法，為骨肉瘤的治療帶來新的希望。