蒼耳子不同萃取相的抗菌及殺蚜活性

周雍 王偉 魏磊 景炳年 劉雨晴 王榮恒 馬艷妮

摘要：旨在研究蒼耳子不同萃取相的體外抑菌活性和殺蟲活性，并采用倍半稀釋法測(cè)定蒼耳子不同萃取相對(duì)9種常見菌的抑制作用，采用浸蟲浸葉法測(cè)定不同萃取相對(duì)繡線菊蚜的毒殺作用。結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取相的抑菌效果明顯，最小抑菌濃度（MIC）均為3.91 mg/mL，對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌的最小殺菌濃度（MBC）為31.25 mg/mL;石油醚、乙酸乙酯萃取相對(duì)繡線菊蚜有較好的毒殺作用，其24 h時(shí)的LC50分別為2.368、2.524 mg/mL，48 h時(shí)的LC50分別為1.743、1.774 mg/mL。由結(jié)果可知，蒼耳子的有效抑菌殺蟲活性集中在中低極性段。

關(guān)鍵詞：蒼耳子;抑菌作用;殺蟲作用;萃取相;蚜蟲

中圖分類號(hào)： S482.2+92;S482.3+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）21-0165-03

收稿日期：2019-05-17

基金項(xiàng)目：河南省科學(xué)院基本科研項(xiàng)目（編號(hào)：190613035、190413008、190613034）。

作者簡介：周雍（1990—），女，河南周口人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事天然產(chǎn)物的功能活性研究。Tel：（0371）65353099;E-mail：1483724982@qq.com。

通信作者：馬艷妮，博士，助理研究員，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。Tel：（0371）55935563;E-mail：ni-2003@163.com。

蒼耳子為菊科植物蒼耳（Xanthium sibiricum）干燥成熟帶總苞的果實(shí)，又名蒼耳、老蒼子、蒼子、蒼刺頭、毛蒼子、癡頭、猛、羊帶歸等[1]。蒼耳子是一種常用的中藥，其性溫，味辛、苦，歸肺、肝經(jīng)，有小毒，具有散風(fēng)除濕、通鼻竅之功效[2]，在《千金·食治》和《中華人民共和國藥典》各版中都有記載。在臨床上，蒼耳子常用以治療腰腿痛、變態(tài)反應(yīng)性鼻炎、慢性鼻炎、瘧疾、腮腺炎、下肢潰瘍和泌尿系統(tǒng)感染等[3]。

蒼耳子作為傳統(tǒng)中藥，關(guān)于其藥用價(jià)值的研究已經(jīng)非常深入。目前的研究已證實(shí)，蒼耳對(duì)多種植物病原菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，劉林等研究表明，蒼耳全株的不同溶劑提取物對(duì)病原菌菌絲生長的作用效果有差異[4]，同時(shí)有研究證明，蒼耳子煎劑在體外對(duì)銅綠假單胞菌、炭疽桿菌、肺炎球菌、乙型鏈球菌和白喉?xiàng)U菌等多種微生物也具有較強(qiáng)的抑制作用[5-6]。但是，關(guān)于蒼耳子不同萃取相對(duì)菊蚜的殺蟲效果仍未見報(bào)道。眾所周知，農(nóng)藥在病蟲害綜合防治中起著重要作用，對(duì)病蟲害物高效、安全性高的生物性農(nóng)藥，成為當(dāng)今新型農(nóng)藥的發(fā)展方向，特別是植物源殺蟲劑的研究已經(jīng)成為生物農(nóng)藥的研究熱點(diǎn)[7-8]。

蒼耳子提取物中的有效成分是天然的，符合現(xiàn)代抑菌殺蟲的新型農(nóng)藥的健康理念和要求，也滿足人們?nèi)找嬖鲩L的食品安全需求，有很大的開發(fā)價(jià)值和廣闊的市場前景。本研究分析了蒼耳子不同萃取相對(duì)9種致病菌的抑制作用和對(duì)繡線菊蚜的毒殺作用，旨在為進(jìn)一步研究開發(fā)蒼耳子作為抑菌、殺蟲藥物提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試藥物蒼耳子于2017年采自河南南召，由河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)專家董誠明教授鑒定為菊科蒼耳屬植物蒼耳的干燥成熟帶總苞的果實(shí)，將其置于50 ℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干，粉碎過40目篩備用。陽性對(duì)照藥物為銀黃顆粒，購自成都神鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司。

1.1.2供試菌株和蟲體標(biāo)準(zhǔn)菌株鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、肺炎鏈球菌ATCC 49619、大腸桿菌ATCC 25922、化膿性鏈球菌ATCC 19615、金黃色葡萄球菌ATCC 29213，均購自南京便診生物科技有限公司。

臨床菌株雞大腸桿菌CVCC 1555、雞金黃色葡萄球菌CVCC 548、雞白痢沙門氏菌CVCC 1887、牛無乳鏈球菌CVCC 540，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。繡線菊蚜采集自河南省開封市菊花培育基地。

1.1.3主要試驗(yàn)試劑與儀器胰蛋白胨，美國Oxoid公司;牛肉浸膏，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;葡萄糖、NaCl，上海華彭實(shí)業(yè)有限公司;瓊脂，北京索萊寶科技有限公司;ME204型分析天平，美國Mettler;LDZX-50型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;MJX-100B-Z型恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;KYC-100B型恒溫培養(yǎng)搖床，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YJ-VS-2無菌操作臺(tái)，無錫一凈凈化設(shè)備有限公司;wi93008型麥?zhǔn)媳葷醿x，東西儀北京科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1蒼耳子不同萃取相的制備準(zhǔn)確稱量300 g蒼耳子粗粉，用95%乙醇回流提取3次，每次1 h，料液比分別為1 g ∶10 mL、1 g ∶8 mL、1 g ∶8 mL，趁熱抽濾，將濾液濃縮至無醇味，用水稀釋至800 mL，依次用石油醚（300 mL×3次）、乙酸乙酯（300 mL×3次）、正丁醇（300 mL×3次）萃取，濃縮各有機(jī)相及水相，分別標(biāo)記為A相、B相、C相、D相。

1.2.2抗菌試驗(yàn)

1.2.2.1細(xì)菌復(fù)蘇及菌懸液的制備將9種供試細(xì)菌先進(jìn)行斜面復(fù)蘇，然后接種于固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h。從固體培養(yǎng)基上挑取明顯的單菌落接種到液體培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)24 h，然后將該菌液用液體培養(yǎng)基稀釋成濃度為1×106～1×108 CFU/mL的菌懸液，備用。

1.2.2.2最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定采用倍半稀釋法[9-11]測(cè)定各樣品的最小抑菌濃度。首先將各樣品與陽性藥物銀黃顆粒配制成初始質(zhì)量濃度為500 mg/mL的水溶液，即樣品原液。再用液體培養(yǎng)基依次對(duì)配好的樣品、陽性藥物進(jìn)行倍半稀釋，一共稀釋為7個(gè)濃度，即濃度依次為250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91 mg/mL。將稀釋液按濃度大小依次加入96孔板中，每孔100 μL，然后分別加入各供試菌液100 μL。對(duì)每種菌液分別設(shè)置陰性對(duì)照組（100 μL菌液+100 μL液體培養(yǎng)基）和空白對(duì)照組（只加100 μL液體培養(yǎng)基）。將制備好的96孔板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，觀察結(jié)果。各測(cè)試組中明顯澄清的孔所對(duì)應(yīng)的最小檢測(cè)質(zhì)量濃度即為該組的MIC。

1.2.2.3最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定MIC試驗(yàn)結(jié)束后，分別從各澄清孔取少量液體，用平板劃線法在固體培養(yǎng)基上劃線，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。完全無細(xì)菌生長的各平板所對(duì)應(yīng)的最小檢測(cè)質(zhì)量濃度即為其最小殺菌濃度。

1.2.3殺蟲活性的測(cè)定繡線菊蚜毒力試驗(yàn)采用浸蟲浸液法[12]。將各待測(cè)樣品用5%二甲基亞砜（DMSO）+0.5%吐溫-80水溶液溶解配制成10 mg/mL濃度的初篩濃度，將帶有蚜蟲的菊葉采下，用毛筆仔細(xì)剔除不合要求的個(gè)體，將其浸入待測(cè)樣品溶液中，5 s后取出并用濾紙吸除多余藥液，然后置于加蓋保濕培養(yǎng)皿中，在室內(nèi)20～25 ℃下培養(yǎng)，光—暗周期為12 h—12 h，分別于24、48 h記錄活蟲數(shù)，每個(gè)濃度重復(fù)處理3次，以5% DMSO+0.5%吐溫-80水溶液處理作對(duì)照。再根據(jù)初篩結(jié)果設(shè)置濃度梯度進(jìn)行檢測(cè)，按照下列公式計(jì)算：

死亡率=死蟲數(shù)/總蟲數(shù)×100%;

校正死亡率=（處理組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）×100%。

1.3數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0方差分析程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Finney概率分析法求得毒力回歸方程和LC50。

2結(jié)果與分析

2.1蒼耳子不同萃取相的得率

蒼耳子用95%乙醇回流提取、濃縮后加水稀釋，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取后，得到不同極性的A相、B相、C相、D相，結(jié)果見表1，其中D相（水相）得率最高，其次是A相，B相的得率最低。

2.2蒼耳子不同溶劑萃取相對(duì)9種供試菌的MIC

采用倍半稀釋法測(cè)定不同溶劑萃取相對(duì)9種供試菌的最小抑菌濃度，從表2可以看出，B相、C相、D相這3個(gè)萃取相都有抑菌性，而且B相、C相的抑菌效果比陽性對(duì)照組銀黃顆粒好。其中，B相的抑菌效果最為明顯，對(duì)于9種供試菌的MIC均為3.91 mg/mL;C相對(duì)金黃色葡萄球菌、雞大腸桿菌、雞金黃色葡萄球菌、牛無乳鏈球菌這4種菌的效果較好，MIC均為15.63 mg/mL，對(duì)于其他5種菌的MIC均為31.25 mg/mL;D相對(duì)大腸桿菌、雞金黃色葡萄球菌的抑菌效果較差，對(duì)于其他7種菌的MIC均為62.5 mg/mL。

2.3蒼耳子不同溶劑萃取相對(duì)9種供試菌的MBC

從表3可以看出，B相、C相這2個(gè)萃取相都有殺菌活性，而且普遍比陽性對(duì)照組銀黃顆粒的殺菌效果好。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，B相對(duì)鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌的殺菌效果最強(qiáng)，MBC為31.25 mg/mL，對(duì)其他7種菌的MBC為62.50 mg/mL;C相對(duì)雞金黃色葡萄球菌的殺菌效果最好，MBC為31.25 mg/mL，對(duì)于金黃色葡萄球菌、雞大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、牛無乳鏈球菌的MBC為62.50 mg/mL，說明C相對(duì)禽畜病原菌具有較好的殺滅效果。

2.4蒼耳子不同溶劑萃取相對(duì)繡線菊蚜的殺蟲活性測(cè)試結(jié)果

由表4可以看出，濃度為10 mg/mL的各組樣品處理24 h后，A相、B相對(duì)繡線菊蚜的殺蟲率（校正死亡率）分別為9196%、89.47%，處理48 h后的殺蟲率分別為94.39%、9582%。C相、D相的殺蟲率均低于50%，作用效果不明顯。針對(duì)效果好的A相、B相進(jìn)一步進(jìn)行毒力測(cè)試，濃度梯度分別為10、8、6、4、2 mg/mL。由表5可以看出，A相24、48 h的半數(shù)致死濃度（LC50）分別為2.368、1.743 mg/mL，B萃取相24、48 h的LC50分別為2.524、1.774 mg/mL，這說明蒼耳子石油醚萃取相和乙酸乙酯萃取相對(duì)繡線菊蚜有明顯的毒殺活性。

3討論與結(jié)論

本研究表明，蒼耳子具有較好的殺菌作用，且廣譜抗菌性強(qiáng)，其中，乙酸乙酯萃取部位對(duì)5種待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌和4種畜禽病原菌的殺菌效果最好，這也為蒼耳子藥材資源的進(jìn)一步開發(fā)提供了新的思路。

蒼耳子有較好的殺蟲活性，且殺蟲譜廣，例如趙茜研究發(fā)現(xiàn)，蒼耳子無水乙醇提取物濃度為2 mg/mL時(shí)，對(duì)菜蚜的校正死亡率為80.7%，濃度為1 mg/mL時(shí)，對(duì)菜蚜的校正死亡率達(dá)到50%[13];馬麗等研究發(fā)現(xiàn)，蒼耳子乙醇提取物具有選擇性殺蟲作用，在終濃度為60 μg/cm2時(shí)，對(duì)棉鈴蟲的毒殺率達(dá)100%[14]。本研究中對(duì)繡線菊蚜的殺蟲試驗(yàn)結(jié)果表明，蒼耳子石油醚、乙酸乙酯萃取部位具有明顯的殺蟲活性，處理24 h后的LC50分別為2.368、2.524 mg/mL，處理48 h后的LC50分別為1.743、1.774 mg/mL。

劉娟娟等研究發(fā)現(xiàn)，蒼耳子對(duì)甘藍(lán)蚜的觸殺作用較好，經(jīng)與百部、瑞香狼毒、藜蘆復(fù)配后其校正死亡率可達(dá)93.1%，明顯高于單味藥材[15]。因此，后續(xù)可開展蒼耳子和其他中藥的配伍活性研究。

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