面向生物打印的組織工程支架材料選配

武力，亓春偉，陳勇，李欣芯，馮銘龍，許龍賀

(大連交通大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，遼寧 大連 116028)*

0 引言

三維打印技術(shù)(3D Printing)即快速成型技術(shù)，它以數(shù)字模型文件為基礎(chǔ)，運(yùn)用金屬、陶瓷或高分子等材料，通過(guò)逐層打印的方式來(lái)構(gòu)造結(jié)構(gòu)體[1].目前，3D打印技術(shù)在醫(yī)療上的應(yīng)用逐漸廣泛，涉及到醫(yī)學(xué)模型[2]、手術(shù)導(dǎo)板[3]、個(gè)性化化植入物[4]、生物組織支架[5]、體外細(xì)胞結(jié)構(gòu)體[6]等等.組織工程是運(yùn)用工程科學(xué)與生命科學(xué)的基本原理和技術(shù)，研究與開(kāi)發(fā)生物替代物 ,從而恢復(fù)、維持和改進(jìn)人體組織功能的一門(mén)新興交叉學(xué)科[7].運(yùn)用三維生物打印技術(shù)打印人體組織結(jié)構(gòu)，構(gòu)建體外細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，對(duì)于藥物研發(fā)、組織再生和器官移植具有積極推動(dòng)作用.Tina Qing Huang等采用PEGDA/LAP/HMBS的混合材料通過(guò)3D打印技術(shù)制造仿生微觀結(jié)構(gòu)用于癌細(xì)胞移植[8].Falguni Pati等采用PCL材料，通過(guò)熔融沉積打印技術(shù)打印出細(xì)胞加載的支架結(jié)構(gòu)[9].M. Enamul Hoque等采用PCL/PEG材料打印出組織細(xì)胞三維支架[10]. 本文以體外構(gòu)建組織工程支架為目標(biāo)，基于生物3D打印機(jī)，從選擇材料開(kāi)始，以析因試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇出材料配比，為后期打印多孔支架，培養(yǎng)體外細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，進(jìn)行個(gè)性化測(cè)試奠定基礎(chǔ).

1 生物打印機(jī)與打印

在選擇材料配比的過(guò)程中，以德國(guó)envision TEC公司開(kāi)發(fā)的3D-Biopiotter生物打印機(jī)的點(diǎn)膠針筒擠出材料長(zhǎng)度作為評(píng)價(jià)材料配比的依據(jù).其工作原理是通過(guò)擠壓針頭在三個(gè)維度上的移動(dòng)，將處于流體、熔融、膠體和糊狀的材料以連續(xù)線條或者單點(diǎn)方式沉積形成三維結(jié)構(gòu)體.打印的材料涉及金屬、陶瓷、高分子等，單一材料、混合材料或多種材料均可單獨(dú)或者同時(shí)利用生物打印機(jī)進(jìn)行打印，但必須制成能動(dòng)性的流體.

生物材料(Biomaterials)是近年來(lái)快速發(fā)展的新興學(xué)科，是材料學(xué)、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、工程學(xué)的交叉融合，被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、新型制造、生物技術(shù)等領(lǐng)域[11].狹義上的生物材料是指生物醫(yī)用材料(Biomedical Materials)，是一類(lèi)用于診斷、治療、修復(fù)或替換人體組織、器官或增進(jìn)其功能的新型高技術(shù)材料.生物醫(yī)用材料按材料的組成和性質(zhì)可以分類(lèi)如下：金屬材料、生物陶瓷和高分子材料.對(duì)于金屬和生物陶瓷材料，雖具有生物相容性，但是不具有生物降解性，因此不能作為組織工程支架的選材，而高分子材料同時(shí)具備生物相容性與生物降解性，所以從高分子材料中選擇支架材料.通過(guò)篩選確定天然高分子材料明膠與海藻酸鈉作為打印材料.明膠與海藻酸鈉的相關(guān)特性介紹，見(jiàn)表1.

表1 明膠與海藻酸鈉的特性

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 設(shè)計(jì)試驗(yàn)

析因設(shè)計(jì)又稱全因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，是將實(shí)驗(yàn)中涉及的全部實(shí)驗(yàn)因素的各水平全面組合形成不同的實(shí)驗(yàn)條件，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行兩次或兩次以上的獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)[12].本試驗(yàn)涉及四個(gè)因素：明膠和海藻酸鈉的用量、溫度、壓力，各因素有不同的水平，將全部因素的各水平組合成不同的試驗(yàn)進(jìn)行，測(cè)量每一個(gè)試驗(yàn)下的擠出長(zhǎng)度，現(xiàn)將各因素與各水平介紹如下，見(jiàn)表2.

表2 因素與水平明細(xì)

2.2 材料配制

明膠和海藻酸鈉選用成都艾科，AR.配制過(guò)程如下：

(1)首先用電子稱稱量一定質(zhì)量的明膠與海藻酸鈉，然后用量筒量取一定量的去離子水，倒入燒杯中，用玻璃皿蓋在燒杯口；

(2)用磁力加熱攪拌器加熱到一定溫度，將明膠加入燒杯，停止加熱，同時(shí)用磁力攪拌器開(kāi)始攪拌，直至明膠全部溶解且形成均一溶液；

(3)最后加入海藻酸鈉，一邊加熱一邊攪拌，當(dāng)溫度升至一定溫度后，停止加熱，但是繼續(xù)攪拌.

(4)隔一段時(shí)間加熱一次，升至一定溫度，如此反復(fù)幾次，至最終配成均一混合溶液；

在析因試驗(yàn)中，不同配比的材料采用相同配置條件，避免配置溶液的各因素對(duì)后續(xù)試驗(yàn)造成影響，將配置成功的混合水溶液裝入點(diǎn)膠管內(nèi)，為進(jìn)一步試驗(yàn)做準(zhǔn)備.為了方便記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)不同配比下的混合溶液進(jìn)行編號(hào)，從下至上，從左到右，依次編號(hào)為1、2、3、……、16，如圖1.

圖1 不同濃度配比下的編號(hào)

2.3 數(shù)據(jù)收集

將配置成功的均一混合水溶液裝入點(diǎn)膠針筒內(nèi)，加裝塞子，并排除針筒內(nèi)的空氣，旋擰上針頭，加載在生物打印機(jī)的打印倉(cāng)內(nèi)，調(diào)節(jié)打印機(jī)的相關(guān)參數(shù)以及進(jìn)行相關(guān)設(shè)置，為收集數(shù)據(jù)做準(zhǔn)備.因?yàn)殡S著溫度的降低，混合水溶液發(fā)生脫水與交聯(lián)現(xiàn)象，所以對(duì)于同一配比濃度下的混合水溶液，將溫度從30～25～20～15℃進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn).將同一溫度下的混合水溶液，調(diào)節(jié)壓力從40～80～120～160～200 kPa變化.將同一配比濃度下的混合水溶液，在一定時(shí)間內(nèi)、不同溫度、不同壓力下的擠出長(zhǎng)度記錄在表格中.現(xiàn)將數(shù)據(jù)收集過(guò)程中出現(xiàn)的相關(guān)問(wèn)題予以說(shuō)明，在30℃保溫的過(guò)程中，不同配比濃度的混合水溶液均在針頭形成懸滴，則說(shuō)明30℃混合溶液流動(dòng)性較高，而且在30℃時(shí)，無(wú)法形成均勻的懸掛在針頭上的一根線條，兩個(gè)懸滴展示如圖2.在25℃時(shí)，材料能夠形成均勻的線條， 在20℃時(shí)， 有輕微彎曲現(xiàn)象，在15℃時(shí)，彎曲較重且毛刺現(xiàn)象明顯，現(xiàn)將10g明膠與1.5 g海藻酸鈉混合溶液， 不同溫度的出絲展現(xiàn)出來(lái)，如圖3.通過(guò)對(duì)不同溫度下線條的變化可知，說(shuō)明隨著溫度的降低，材料表現(xiàn)出不同特性.

(a)

(b)

(a) 25℃線條

(b) 20℃線條

(c) 15℃線條

2.4 數(shù)據(jù)處理與試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)收集到的在不同濃度配比下，不同溫度，不同壓力下的擠出長(zhǎng)度的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，將所有數(shù)據(jù)分成四個(gè)不同溫度下進(jìn)行處理，以橫軸為不同配比濃度，縱軸為擠出長(zhǎng)度，繪制得到在不同溫度下，不同壓力條件下，不同配比濃度下的擠出長(zhǎng)度，在30℃條件下，如圖4所示，在25℃條件下，如圖5所示，在20℃條件下，如圖6所示，在15℃條件下，如圖7所示.

從圖4中可知，在30℃時(shí)，在不同濃度的混合水溶液中，即使在最小壓力40 kPa的情況下，擠出長(zhǎng)度最短為20 mm，擠出長(zhǎng)度在實(shí)際打印中作為擠出速度的參考，對(duì)于擠出長(zhǎng)度為20 mm來(lái)說(shuō)，相應(yīng)的擠出速度過(guò)大，則在30℃時(shí)，即使采用較小的壓力，所有濃度溶液均無(wú)法進(jìn)行打印操作.

圖4 30℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長(zhǎng)度

從圖5中可知，在Ⅰ區(qū)，擠出長(zhǎng)度較大，在Ⅱ區(qū)中，壓力為40 kPa的時(shí)候，基本上擠不出，而隨著壓力的增大，擠出長(zhǎng)度劇增，在Ⅲ區(qū)，材料擠出長(zhǎng)度相對(duì)趨于穩(wěn)定，呈逐漸減小的趨勢(shì)，而在Ⅳ區(qū)，擠出長(zhǎng)度趨于零，從不同區(qū)擠出長(zhǎng)度的變化可知，在Ⅲ區(qū)，則比較適合打印.

圖5 25℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長(zhǎng)度

從圖6中可知，在Ⅱ區(qū)，相對(duì)于圖5中的Ⅱ區(qū)，材料擠出長(zhǎng)度明顯減小，說(shuō)明混合水溶液的穩(wěn)定性較差，在Ⅲ區(qū)中，除編號(hào)9材料擠出長(zhǎng)度發(fā)生波動(dòng)變化較大之外，其他配比濃度下則相對(duì)穩(wěn)定，且擠出長(zhǎng)度逐漸減小.

圖6 20℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長(zhǎng)度

從圖7中可知，在15℃時(shí)，在不同濃度的混合溶液中，當(dāng)溶液粘稠度較低時(shí)，擠出長(zhǎng)度較大，而其他情況下，擠出長(zhǎng)度基本上為零，即無(wú)法擠出材料，則實(shí)際打印過(guò)程中無(wú)法進(jìn)行打印，材料穩(wěn)定性較差，通過(guò)查閱資料可知由于溫度較低，混合水溶液會(huì)發(fā)生脫水與物理交聯(lián)現(xiàn)象，因此，在15℃的條件下，并不是理想的打印溫度.

圖7 15℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長(zhǎng)度

由圖4～圖7可知以下結(jié)果：

(1)Ⅰ、Ⅱ 、Ⅲ、Ⅳ區(qū)在相同壓力與溫度的條件下，隨著海藻酸鈉濃度的增加，擠出長(zhǎng)度成變短趨勢(shì)，即隨著海藻酸鈉濃度的增加，溶液粘稠度增加.

(2)編號(hào)從1-5-9-13，2-6-10-14，3-7-11-15，4-8-14-16變化時(shí)，在相同壓力與溫度條件下，隨著明膠濃度的增加，擠出長(zhǎng)度成變短趨勢(shì)，即隨著明膠濃度的增加，溶液粘稠度增加.

(3)編號(hào)從1-6-11-16變化時(shí)，可知在相同溫度與壓力條件下，隨著同時(shí)增加明膠與海藻酸鈉配比濃度，擠出長(zhǎng)度變短的趨勢(shì).

(4)在相同濃度與溫度的條件下，隨著壓力的增加，擠出長(zhǎng)度呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)；在相同濃度與壓力的條件下，隨著溫度的降低，擠出長(zhǎng)度呈現(xiàn)縮短趨勢(shì)；在相同壓力與溫度的條件下，隨著濃度的增加，擠出長(zhǎng)度呈現(xiàn)縮短趨勢(shì).

從(1)(2)結(jié)果分析可知，擠出長(zhǎng)度隨著一種材料濃度發(fā)生變化的情況，從(3)可知，擠出長(zhǎng)度隨著兩種材料濃度同時(shí)增加的變化情況.從(4)可知，在不同濃度、壓力和溫度的相互關(guān)系中，擠出長(zhǎng)度變化趨勢(shì)，從圖4、圖7可知，在30℃和15℃條件下，擠出長(zhǎng)度的變化趨勢(shì)，同時(shí)根據(jù)擠出長(zhǎng)度的趨勢(shì)知在30℃和15℃的條件下，不可進(jìn)行相關(guān)打印試驗(yàn).從圖5、圖6可知，在Ⅰ區(qū)中，擠出長(zhǎng)度太長(zhǎng)，無(wú)法進(jìn)行打印，在Ⅳ區(qū)內(nèi)，擠出長(zhǎng)度幾乎全部為零，也無(wú)法進(jìn)行打印，在Ⅱ區(qū)，材料穩(wěn)定性較差，擠出長(zhǎng)度波動(dòng)性較大，在Ⅲ區(qū)中，除編號(hào)9材料擠出長(zhǎng)度發(fā)生波動(dòng)變化較大之外，其他配比濃度下則相對(duì)穩(wěn)定，逐漸趨于零，通過(guò)以上分析可知，則選擇在25℃下，編號(hào)10作為打印最佳配比較好，依據(jù)相關(guān)壓力，進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)參數(shù)優(yōu)化，為打印相關(guān)結(jié)構(gòu)體，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)以及個(gè)性化檢測(cè)奠定基礎(chǔ).

3 結(jié)論

采用明膠與褐藻酸鈉作為生物打印材料，運(yùn)用析因試驗(yàn)法進(jìn)行了材料擠出性能試驗(yàn)，測(cè)量了16種不同配比溶液分別在15、20、25、30℃溫度和40、80、120、160、200 kPa壓強(qiáng)下的生物打印機(jī)點(diǎn)膠針頭擠出長(zhǎng)度，繪制了15℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長(zhǎng)度、20℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長(zhǎng)度、25℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長(zhǎng)度、30℃不同濃度溶液配比在不同壓力下的擠出長(zhǎng)度的四條曲線，以擠出材料性態(tài)和擠出長(zhǎng)度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析得出在25℃，壓力200 kPa的條件下，15 g明膠與1 g海藻酸鈉配制的混合溶液的擠出長(zhǎng)度適合打印，為進(jìn)一步優(yōu)化打印參數(shù)與打印相關(guān)結(jié)構(gòu)體，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)以及個(gè)性化檢測(cè)奠定基礎(chǔ).