鞘內(nèi)阻斷趨化因子配體12/趨化因子受體4趨化因子軸對選擇性神經(jīng)損傷模型大鼠前扣帶皮層中膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

黃雪花 戴麗華 楊悅橙 馬 柯

神經(jīng)病理性疼痛(NP)是由軀體感覺系統(tǒng)的損傷或疾病引起的疼痛。NP疼痛程度劇烈,臨床治療效果欠佳,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜不清,中樞敏化是其重要的發(fā)病機(jī)制之一。研究結(jié)果表明,星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞敏化中具有重要作用[1],膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志物,而趨化因子在NP中具有重要作用[2]。趨化因子受體(CXCR)4在體內(nèi)大部分組織和器官上都有表達(dá),趨化因子配體(CXCL)12/CXCR4趨化因子軸參與體內(nèi)多種生理或病理生理功能,包括NP、人類免疫缺陷病毒侵染、造血功能、胚胎發(fā)育和腫瘤遷移等,因此趨化因子及其受體可能成為疾病治療新的分子靶點(diǎn)。本研究建立選擇性神經(jīng)損傷(SNI)模型,觀察造模后大鼠前扣帶皮層(ACC)中GFAP的表達(dá)情況,并觀察鞘內(nèi)注射CXCR4抑制劑AMD3100阻斷CXCL12/CXCR4趨化因子軸對大鼠ACC中GFAP表達(dá)和大鼠痛覺超敏的影響,旨在為治療NP提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 96只健康、清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供,體重220～260 g,動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2013-0016,動物使用許可證號為SYXK(滬)2013-0106。

1.2 主要儀器和試劑 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號為Chemidoc XRS,美國Bio-Rad公司),Western凝膠電泳套件(EPS-300,上海精密儀器儀表公司),全波長酶標(biāo)儀(BIO-TEK,上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司),熒光顯微鏡(DMI-3008,德國Leica公司)。AMD3100(批號為 A5602,美國Sigma公司),抗 GFAP抗體(英國 Abcam 公司),抗GAPDH抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 分組 將96只大鼠飼養(yǎng)于空氣過濾系統(tǒng)適應(yīng)環(huán)境2 d,隨機(jī)分為假手術(shù)未治療組、假手術(shù)治療組、SNI未治療組、SNI治療組,每組24只。

1.4 鞘內(nèi)置管和利多卡因測試 于大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(290～340 mg/kg)麻醉后,將其妥善固定,在L4與L5間隙處消毒,作長1.0～1.5 cm的皮膚縱向切口,依次切開皮膚和淺筋膜,顯露肌層,在棘突旁用尖刀背部鈍性分離附著于L4至L5棘突一側(cè)的肌肉,暴露白色椎板,在L4與L5兩關(guān)節(jié)突結(jié)合處內(nèi)側(cè),用無齒鑷子夾著聚乙烯硬膜外導(dǎo)管前端,輕柔地將導(dǎo)管向上置入。如置管順利,則大鼠會出現(xiàn)甩尾反射,此時導(dǎo)管內(nèi)可見清亮的腦脊液流出。鞘內(nèi)置管后第2天行利多卡因測試。取出并剪除聚乙烯導(dǎo)管盲端,應(yīng)用25μL微量注射器注射2%利多卡因7μL,以大鼠雙下肢出現(xiàn)暫時性癱瘓現(xiàn)象作為鞘內(nèi)置管成功的標(biāo)志。

1.5 SNI動物模型的制備和AMD3100鞘內(nèi)注射 根據(jù)Decosterd和Woolf[3]描述的方法,于大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(290～340 mg/kg)后,將其置于俯臥位,常規(guī)消毒鋪巾,縱向切開左側(cè)大腿的皮膚、淺筋膜,斷開股二頭肌,充分暴露坐骨神經(jīng)及其末端腓腸神經(jīng)、腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)分支。SNI未治療組和SNI治療組用5/0絲線分別結(jié)扎腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)并予切斷,保留腓腸神經(jīng)完整;假手術(shù)未治療組和假手術(shù)治療組僅暴露但不結(jié)扎神經(jīng)。術(shù)后均肌內(nèi)注射青霉素4萬～5萬U預(yù)防感染。假手術(shù)治療組和SNI治療組術(shù)后鞘內(nèi)連續(xù)注射AMD3100 10μL(含AMD3100 1μg,每天1次,連續(xù)2周),假手術(shù)未治療組和SNI未治療組在同時間點(diǎn)鞘內(nèi)注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.6 機(jī)械性刺激縮足閾值(PWT)測定 根據(jù)Tal等[4]的方法,于SNI術(shù)前和首次注藥后7、14、21、28、35 d上午測定大鼠PWT。將大鼠放置在有機(jī)玻璃箱(86 cm×20 cm×14 cm)內(nèi),箱的底面為有孔的金屬篩網(wǎng),讓大鼠在有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)30 min后,用von-Frey細(xì)絲(美國North Coast Medical公司)垂直刺激大鼠左后足底部外側(cè)皮膚,刺激值由小逐漸增大,大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應(yīng),記錄出現(xiàn)陽性反應(yīng)時的刺激數(shù)值,循環(huán)測試3次取平均值。

1.7 ACC取材和海馬中GFAP蛋白質(zhì)水平檢測①Western印跡法檢測ACC中GFAP蛋白質(zhì)表達(dá)水平:每組分別于首次注藥后14、21、28、35 d各取4只大鼠,腹腔內(nèi)注射麻醉后用鍘刀快速斷頭,用咬骨鉗鉗掉大腦兩側(cè)的顱骨,剝除腦膜,取出完整的大腦,分離ACC,隨即放入液氮中保存?zhèn)溆谩７Q取等量組織標(biāo)本后,按比例加入蛋白酶抑制劑和細(xì)胞裂解液,組織勻漿后,4℃12 879×g離心15 min,取上清液,采用二辛可寧酸法(BCA法)測定蛋白質(zhì)濃度。加入十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液,變性30 min(55℃),蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜,轉(zhuǎn)膜75 min(恒流300 m A),5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,一抗4℃搖床孵育過夜(GFAP 1∶5 000,GAPDH 1∶8 000)。以Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS)+吐溫(TBST)緩沖液沖洗3次,每次10 min;HRP酶標(biāo)二抗室溫孵育1 h;再次以TBST緩沖液沖洗3次,每次10 min;ECL顯色曝光。以內(nèi)參照與目標(biāo)蛋白質(zhì)的灰度比值表示目的蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。② 免疫熒光法觀察ACC中GFAP蛋白質(zhì)表達(dá)情況:每組分別于首次注藥后14、28 d各取4只大鼠,在腹腔內(nèi)注射麻醉后,將大鼠沖洗至通體變白,以4℃4%多聚甲醛溶液約300 m L灌注固定,灌注時間為20～25 min。灌注完畢后取出完整的大腦,固定和脫水后包埋制作冰凍切片。將30μm切片經(jīng)5%驢血清加0.3%Triton X-100封閉破膜0.5 h后,將GFAP 1∶1 000加入1% 牛血清白蛋白(BSA)4℃孵育過夜,熒光標(biāo)記二抗37℃孵育45 min,置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。細(xì)胞扁平、胞體突起較多較粗,有多個分枝,熒光染色深者為陽性細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。4組PWT總趨勢比較采用重復(fù)測量方差分析,成組設(shè)計(jì)的多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PWT的變化 術(shù)前4組間PWT基礎(chǔ)值的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＞0.05),SNI未治療組首次注藥后7、14、21、28、35 d的PWT值均顯著低于假手術(shù)未治療組和假手術(shù)治療組同時間點(diǎn)(P值均＜0.01),SNI治療組首次注藥后14、21、28、35 d的PWT值均顯著高于SNI未治療組同時間點(diǎn)(P值均＜0.01)。見表1。

表1 4組大鼠術(shù)前和注藥后各時間點(diǎn)的PWT值比較 (N=24,±s,g)

表1 4組大鼠術(shù)前和注藥后各時間點(diǎn)的PWT值比較 (N=24,±s,g)

與假手術(shù)未治療組比較:①P＜0.01;與假手術(shù)治療組比較:②P＜0.01;與SNI未治療組比較:③P＜0.01

組別 術(shù)前 首次注藥后7 d 首次注藥后14 d 首次注藥后21 d 首次注藥后28 d 首次注藥后2 23.42±3.08 24.41±0.29假手術(shù)治療 24.01±4.52 22.52±3.18 23.31±2.91 24.19±2.85 23.51±3.86 23.82±4.21 SNI未治療 23.46±4.82 4.72±4.43①② 3.67±1.67①② 4.44±1.67①② 4.80±1.79①② 5.33±1.15①②SNI治療 23.80±4.61 8.28±5.43 6.71±2.55③ 7.64±1.75③ 8.25±1.28③ 8.00±1.63 35 d假手術(shù)未治療 23.12±3.12 21.67±5.02 21.60±4.02 23.84±4.9③

2.2 Western印跡法檢測ACC中GFAP蛋白質(zhì)水平 首次注藥后14和21 d,4組間大鼠ACC中GFAP蛋白質(zhì)相對表達(dá)量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＞0.05)。首次注藥后28和35 d,SNI未治療組大鼠ACC中GFAP蛋白質(zhì)相對表達(dá)量均顯著高于假手術(shù)未治療組和假手術(shù)治療組同時間點(diǎn)(P值均＜0.05),SNI治療組大鼠ACC中GFAP蛋白質(zhì)相對表達(dá)量均顯著低于SNI未治療組同時間點(diǎn)(P值均＜0.05),假手術(shù)未治療組與假手術(shù)治療組間大鼠ACC中GFAP蛋白質(zhì)相對表達(dá)量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＞0.05)。見表2。

表2 4組大鼠注藥后各時間點(diǎn)ACC中GFAP蛋白質(zhì)相對表達(dá)量比較 (N=4,±s)

表2 4組大鼠注藥后各時間點(diǎn)ACC中GFAP蛋白質(zhì)相對表達(dá)量比較 (N=4,±s)

與假手術(shù)未治療組比較:①P＜0.05;與假手術(shù)治療組比較:②P＜0.05;與SNI未治療組比較:③P＜0.05

組別 首次注藥后14 d 首次注藥后21 d 首次注藥后28 d 首次注藥后1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00假手術(shù)治療 1.02±2.21 1.08±2.89 1.16±2.05 1.03±3.14 SNI未治療 1.01±0.12 1.19±0.87 2.69±2.98①② 2.62±4.87①②SNI治療 1.12±0.32 1.28±0.11 1.28±2.13③ 1.34±0.02 35 d假手術(shù)未治療③

2.3 免疫熒光法觀察ACC中GFAP的蛋白質(zhì)表達(dá) 在首次注藥后14 d時,4組大鼠ACC中GFAP蛋白質(zhì)表達(dá)無明顯異常;而在首次注藥后28 d時,SNI未治療組大鼠ACC中GFAP蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增多,主要表現(xiàn)為陽性細(xì)胞數(shù)增多,著色較深。見圖1。

圖1 4組大鼠首次注藥后14和28 d時ACC中GFAP蛋白表達(dá)(免疫熒光染色,×400)

3 討 論

本研究結(jié)果提示,鞘內(nèi)阻斷CXCL12/CXCR4趨化因子軸可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)ACC中GFAP表達(dá)水平降低,緩解NP的癥狀。

NP的一個重要發(fā)病機(jī)制是中樞敏化。研究[5]結(jié)果表明,除神經(jīng)元之外,神經(jīng)元周圍的膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)在慢性疼痛中樞敏化的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮著不可忽視的作用。在正常情況下,神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞處于未激活狀態(tài),但在神經(jīng)損傷或神經(jīng)系統(tǒng)疾病時會被激活,處于反應(yīng)性狀態(tài),并參與神經(jīng)疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。CXCL12/CXCR4趨化因子軸是由CXCL12與其特異性受體CXCR4相互作用而構(gòu)成的與細(xì)胞間信息傳遞、細(xì)胞遷移有密切關(guān)系的耦聯(lián)分子對[6-7]。大量研究結(jié)果表明,在骨癌痛、炎性痛、腫瘤轉(zhuǎn)移等模型中CXCR4表達(dá)均上調(diào)[8-9],抑制CXCR4可緩解痛覺過敏。CXCL12及其受體CXCR4如何參與NP的發(fā)生和維持,以及其是否與膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)目前尚未知曉。

本研究在SNI模型大鼠鞘內(nèi)注射CXCR4特異性抑制劑AMD3100阻斷CXCL12/CXCR4趨化因子軸,采用免疫熒光法觀察大鼠ACC中GFAP蛋白質(zhì)表達(dá),結(jié)果顯示,SNI未治療組和SNI治療組大鼠ACC中GFAP蛋白質(zhì)表達(dá)在首次注藥后14、21 d前與假手術(shù)未治療組和假手術(shù)治療組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但在首次注藥后28、35 d時SNI未治療組ACC中GFAP蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào),而SNI治療組ACC中GFAP蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯低于SNI未治療組。由此可以推測,CXCL12/CXCR4趨化因子軸參與NP的發(fā)生和維持與星形膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。Tanga等[10]應(yīng)用實(shí)時反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)研究脊神經(jīng)橫斷損傷模型發(fā)現(xiàn),外周神經(jīng)損傷后,小膠質(zhì)細(xì)胞激活早于星形膠質(zhì)細(xì)胞?？梢酝茰y,外周神經(jīng)損傷后首先導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子、細(xì)胞因子,產(chǎn)生的趨化因子與神經(jīng)元表面的CXCR結(jié)合后產(chǎn)生更多的趨化因子、細(xì)胞因子,這些趨化因子激活星形膠質(zhì)細(xì)胞,使星形膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)。星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與趨化因子CXCL12和神經(jīng)元表面CXCR4結(jié)合有關(guān),也與NP持續(xù)存在有關(guān)。星形膠質(zhì)細(xì)胞參與較晚期的NP,維持較持久的疼痛狀態(tài)。鞘內(nèi)注射AMD3100后可能阻斷了小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的CXCL12與神經(jīng)元表面CXCR4結(jié)合,阻止星形膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步激活和兩者之間的級聯(lián)放大效應(yīng),從而阻止中樞敏化,緩解患者的疼痛。

ACC參與痛覺特別是痛情緒信息的編碼[11]。對于罹患?xì)堉?、患肢痛、腦卒中后疼痛等NP患者來說,慢性疼痛無疑是一種痛苦的記憶。本研究結(jié)果顯示,4組術(shù)前PWT基礎(chǔ)值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,SNI未治療組在首次注藥后7、14、21、28、35 d的PWT均顯著低于假手術(shù)未治療組和假手術(shù)治療組同時間點(diǎn),提示NP制模成功;同時SNI治療組在首次注藥后14、21、28、35 d時的PWT顯著高于SNI未治療組同時間點(diǎn),表明通過鞘內(nèi)阻斷CXCL12/CXCR4趨化因子軸可以緩解NP,且NP早期緩解不明顯,與遲發(fā)性GFAP表達(dá)減少基本相符。提示在NP時ACC中GFAP的生成與CXCL12/CXCR4趨化因子軸有關(guān),而GFAP水平影響NP的疼痛程度。

綜上所述,CXCL12/CXCR4趨化因子軸在SNI模型中參與痛覺過敏的形成,其機(jī)制可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)ACC中星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。星形膠質(zhì)細(xì)胞參與較晚期的NP,維持較持久的疼痛狀態(tài)。不過目前尚不清楚CXCL12/CXCR4趨化因子軸與膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用與何種信號通路有關(guān),尚需進(jìn)一步深入研究。