三氧化二砷聯(lián)合小白菊內(nèi)酯誘導人骨肉瘤細胞凋亡的實驗研究

滕松齡，陳兵，李崇杰

（沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院 手外1科，遼寧 沈陽 110024）

骨肉瘤是高度惡性的間葉組織腫瘤，好發(fā)于青少年和年輕成人，骨肉瘤在局部呈侵襲性生長并且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，現(xiàn)在多采用化療輔助手術的聯(lián)合療法。但因為骨肉瘤細胞對化療藥物缺乏敏感性，以及單一傳統(tǒng)化療藥物易產(chǎn)生的耐藥性，使得多種抗腫瘤藥物聯(lián)合輔助化療方案日益受到青睞。三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）已經(jīng)被證明對于早幼粒細胞白血病及其他腫瘤細胞有誘導凋亡作用[1，2]。小白菊內(nèi)酯(Parthenolide，PTL)是從草本類植物艾菊內(nèi)純化出的一種倍半萜烯內(nèi)酯化合物，近年來研究發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯具有較強的抗腫瘤活性，在體外可抑制多種腫瘤細胞株的生長增殖，并誘導其凋亡[3]。此外，小白菊內(nèi)酯還可以增強腫瘤細胞對其他多種抗腫瘤藥物的敏感性[4]。因此，我們將小白菊內(nèi)酯與三氧化二砷通過單獨以及聯(lián)合作用于骨肉瘤U2OS細胞株，來觀察研究其誘導骨肉瘤細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤U2OS細胞株采購自中國上海科學院生化細胞研究所，三氧化二砷（北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司），小白菊內(nèi)酯（索萊寶公司），DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清（Thermo公司），MTS試劑盒（美國Promega生物科技公司），倒置相差顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

U2OS細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清培養(yǎng)液），置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代一次。

1.2.2 藥物的給予方法

0.25 %胰酶消化對數(shù)生長期細胞，計數(shù)后，按5×105/mL，將細胞接種于培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后給藥。三氧化二砷組：1，2，4 μmol/L 三種濃度；小白菊內(nèi)酯組：5，10，20 μmol/L三種濃度；以及三氧化二砷2 μmol/L分別聯(lián)合小白菊內(nèi)酯5，10 μmol/L組，同時設立空白對照組。

1.2.3 應用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化

取對數(shù)生長期的細胞用于實驗，單獨及聯(lián)合給予小白菊內(nèi)酯以及三氧化二砷，于24 h后進行細胞形態(tài)學觀察。

1.2.4 MTS法檢測U2OS細胞增殖抑制率

采用MTS法檢測不同濃度三氧化二砷和小白菊內(nèi)酯單獨及聯(lián)合作用對人骨肉瘤U2OS細胞株的增殖抑制率。給予不同濃度的藥物分別作用于U2OS細胞24，48及72h后，加入20μL/孔的MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用酶標儀讀取每孔的吸光度值(OD=490nm)。細胞增殖率（%）=實驗組OD值／對照組OD值×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察U2OS細胞形態(tài)學變化

分別給予劑量為 PTL 2 μmol/L，ATO 5 μmol/L以 及 ATO 2 μmol/L+PTL 5 μmol/L 和 ATO 2 μ mol/L+PTL 10 μmol/L，24 h后觀察骨肉瘤 U2OS細胞。同空白對照組相比，治療組細胞均出現(xiàn)變小變圓，有不同程度的萎縮。而與單獨用藥組相比，聯(lián)合用藥組細胞破壞程度進一步增加，許多細胞脫落后漂浮于培養(yǎng)液中，更多的細胞進入凋亡狀態(tài)（圖1）。

圖1 單獨及聯(lián)合應用三氧化二砷、小白菊內(nèi)酯作用于U2OS細胞的形態(tài)學變化

2.2 不同濃度的三氧化二砷和小白菊內(nèi)酯單獨及聯(lián)合用藥對骨肉瘤U2OS細胞增殖的影響

2.2.1 單獨應用三氧化二砷對U2OS細胞的影響

三氧化二砷對骨肉瘤U2OS細胞具有增殖抑制作用，隨著濃度的增大及時間的增加，抑制作用也逐漸增加（P＜0.05，圖 2）。

2.2.2 單獨應用小白菊內(nèi)酯對U2OS細胞的影響

結果表明小白菊內(nèi)酯可抑制U2OS細胞的增殖，同時同樣存在濃度及時間依懶性，不同濃度及時間點相比較差異有顯著性（P＜0.05，圖3）。

圖2 三氧化二砷單獨作用于U2OS細胞，分別在24,48,72 h計算出生存率

圖3 小白菊內(nèi)脂單獨作用于U2OS細胞，分別在24,48,72 h計算出生存率

2.2.3 聯(lián)合應用三氧化二砷及小白菊內(nèi)酯對U2OS細胞的影響

兩個聯(lián)合應用組分別作用于骨肉瘤細胞，MTS法檢測其24，48，72 h的生存率，結果表明，聯(lián)合給藥組也同樣存在劑量與時間的依賴性，且聯(lián)合給藥組對于骨肉瘤細胞U2OS的增殖抑制作用明顯好于單獨給藥組（P＜0.05，圖 4，5）。

圖4 ，5 聯(lián)合應用作用于U2OS細胞，分別在 24，48，72 h 計算出生存率

3 討論

三氧化二砷可以通過多種信號通路促進腫瘤細胞的凋亡[5，6]，我們的實驗結果也再次證明了三氧化二砷對骨肉瘤U2OS細胞存在增殖抑制作用，且具有時間與劑量的依賴性。但我們考慮到三氧化二砷在高濃度下的毒副作用以及單一用藥時產(chǎn)生的耐藥性等問題，從而想尋找一種可以與其協(xié)同作用，增加療效的藥物。小白菊內(nèi)酯為一種倍半萜稀內(nèi)酯化合物，其已被證明可通過抑制NF kappa B的激活從而誘導腫瘤細胞的凋亡[7]，同時亦發(fā)現(xiàn)其可以作為某些腫瘤的放療或化療的增敏劑[8-10]。本研究顯示應用三氧化二砷聯(lián)合小白菊內(nèi)酯的聯(lián)合給藥組，對骨肉瘤U2OS細胞的增殖抑制作用明顯高于單獨給藥組，同時我們發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合給藥組（2μmol/L三氧化二砷聯(lián)合10 μmol/L小白菊內(nèi)酯）在早期（24 h），即可達到很高的抑制水平，U2OS細胞的增殖抑制率為（71.9±1.64）%。而三氧化二砷及小白菊內(nèi)酯單獨給藥組的增殖抑制率僅為（26.01±3.73）%及（27.82±0.74）%。在較低濃度的小白菊內(nèi)酯及三氧化二砷聯(lián)合給藥組也在48 h后對U2OS細胞的抑制率達到了（72.46±2.13）%，而三氧化二砷與小白菊內(nèi)酯在同一時期的增殖抑制率為（39.76±1.29）%及（25.61±2.45）%。本實驗結果表明，聯(lián)合應用小白菊內(nèi)酯及三氧化二砷對于誘導骨肉瘤U2OS細胞的凋亡具有協(xié)同作用，并存在時間與劑量的依賴性，同時在較低的給藥濃度的條件下，就可達到較理想的協(xié)同抑制效果。因此，我們認為把三氧化二砷與小白菊內(nèi)酯聯(lián)合應用于骨肉瘤的臨床治療，有著良好的前景。同時，對于三氧化二砷及小白菊內(nèi)酯對骨肉瘤U2OS細胞的作用機制等問題，還需進一步的研究。