不同施肥方式下土壤氨氧化細菌的群落特征*

任靈玲, 李秀玲, 劉靈芝

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不同施肥方式下土壤氨氧化細菌的群落特征*

任靈玲, 李秀玲, 劉靈芝**

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院/土肥資源高效利用國家工程實驗室/農(nóng)業(yè)部東北耕地保育重點實驗室 沈陽 110866)

為了研究長期定位施肥對棕壤中氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)種群結(jié)構(gòu)多樣性和垂直分布特征的影響, 本研究采用化學(xué)分析、熒光定量PCR(qPCR)和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù), 針對沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗區(qū)不同施肥方式(不施肥、低量無機氮肥、高量無機氮肥、無機氮肥與有機肥配施)下不同土壤深度(0~20 cm、20~40 cm、40~60 cm)的土壤理化性質(zhì)、AOB豐度及種群多樣性進行分析, 比較不同施肥方式對土壤AOB種群的影響。結(jié)果顯示, 與不施肥相比, 施肥會降低土壤pH, 增加土壤銨態(tài)氮(70.5%~939.21%)和硝態(tài)氮(253.20%~625.48%)含量。隨土壤深度增加, 土壤pH升高, 銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量除低量無機氮肥處理外, 多呈降低趨勢。土壤增施氮肥可提高AOB豐度, 降低總細菌豐度。其中, 0~20 cm土層中AOB豐度較高, 且高量無機氮肥處理的AOB數(shù)量最高, 為9.65×105拷貝數(shù)?g-1(干土)。DGGE圖譜分析顯示, 不同處理下, AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)存在明顯差異(<0.05), 各多樣性指數(shù)均在表層(0~20 cm)最高, 增施氮肥則顯著降低AOB的多樣性。聚類分析表明, 4個施肥處理中, 高量無機氮肥處理聚為一類, 其他處理則因土壤深度不同而異; 3個土壤深度中, 除不施肥處理外, 所有施肥處理均表現(xiàn)為0~20 cm、20~40 cm土層發(fā)生聚類, 40~60 cm則明顯與其他兩層分開。冗余梯度分析(RDA)顯示, 硝態(tài)氮(=0.027)是造成影響AOB群落結(jié)構(gòu)差異的主要原因。上述研究結(jié)果表明, 長期定位施肥土壤AOB的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)多樣性受施肥方式顯著影響, 并表現(xiàn)出明顯的垂直分布特征。與無機氮肥相比, 有機無機配施處理有助于改善土壤pH, 維持不同土壤深度下AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性。

棕壤; 施肥方式; 氮肥; 氨氧化細菌(AOB); 群落結(jié)構(gòu); 土壤深度

硝化作用是土壤氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵過程, 由氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)驅(qū)動的氨氧化過程作為硝化作用的限速步驟, 可通過其數(shù)量、多樣性、結(jié)構(gòu)組成的改變來響應(yīng)土壤氮素轉(zhuǎn)化[1]。許多研究指出, 酸性土壤中長期施肥可改變AOA的豐度和群落結(jié)構(gòu), 中性或堿性土壤中AOB比AOA更敏感。Chen等[2]在研究水稻(L.)酸性紅壤發(fā)現(xiàn), 各施肥處理中AOA豐度變化明顯, 而AOB幾乎沒有區(qū)別。Wu等[3]研究小麥(L.)中性土壤中發(fā)現(xiàn), 長期施肥(22年)顯著改變AOB的群落結(jié)構(gòu), 而AOA則保持不變。近年來, Hayatsu等[4]在日本茶園土壤中成功分離出嗜酸性AOB, 使得這類微生物在酸性土壤中的作用有了新的認知。研究表明, 土壤pH、氮素種類、土壤類型、施肥方式和作物品種等因素, 均可對氨氧化微生物產(chǎn)生特異的選擇性。Fan等[5]研究長期施肥水稻土指出, AOB的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)較AOA變化明顯, 增施氮肥可顯著提高AOB的多樣性。Ai等[6]發(fā)現(xiàn), 小麥與玉米(L.)輪作潮土中, 施加氮肥可顯著提高AOB數(shù)量。Kumar等[7]和Liu等[8]研究酸性土壤時均指出, 配施有機肥可顯著增加土壤中AOB的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)多樣性。Ouyang等[9]在美國的猶他州粉砂壤土中也發(fā)現(xiàn), 有機氮肥可顯著提高AOB-A基因豐度, 且氨氧化細菌的活性隨有機肥料增加而增加。

農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中, 不同施肥方式可通過影響土壤理化特征, 改變功能微生物的豐度及群落結(jié)構(gòu)組成, 進而對土壤質(zhì)量和生態(tài)功能產(chǎn)生影響。許多研究表明, 較單施化肥相比, 無機有機氮肥配施的農(nóng)田管理模式, 有助于優(yōu)化土壤微生物群落結(jié)構(gòu), 改良土壤理化屬性和養(yǎng)分供應(yīng)狀況, 維持并提高土壤質(zhì)量。Kumar等[7]研究長期施肥的水稻土?xí)r指出, 無機有機肥配施可以緩解土壤酸化, 穩(wěn)定土壤功能和豐富功能基因。Zhao等[10]研究小麥與水稻輪作的黏土?xí)r指出, 無機有機肥配施可顯著提高土壤有效養(yǎng)分、微生物量以及微生物多樣性, 對于可持續(xù)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)來說, 無機有機肥配施是一種較好的施肥方式。然而, 在長期施肥模式下, 針對棕壤中氨氧化細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性對不同施肥方式, 特別是有機無機肥配施的響應(yīng)特征, 及其隨土壤深度增加的變化差異等相關(guān)研究少有報道, 這些研究結(jié)果對于探索不同施肥模式下土壤氮素轉(zhuǎn)移與變化規(guī)律具有指導(dǎo)意義。

為進一步認識長期定位不同施肥模式下棕壤氨氧化細菌的變化特征, 采用PCR-DGGE和qPCR技術(shù), 以沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)長期定位試驗田為平臺, 比較4種施肥方式下, 長期定位棕壤AOB的豐度與種群結(jié)構(gòu)差異, 同時結(jié)合土壤理化性質(zhì)的分析, 探討AOB對不同施肥方式的響應(yīng)機制和垂直分布特征, 為維持土壤質(zhì)量、穩(wěn)定生產(chǎn)力提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與樣品采集

試驗地位于遼寧省沈陽市沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)長期定位試驗站(41°49′N, 123°34′E), 該地區(qū)屬于大陸性季風(fēng)氣候, 年平均氣溫8.0 ℃, 年均降水量為705 mm。土壤類型屬于中厚層棕壤。長期定位試驗始于1987年, 種植作物為玉米。施肥方式設(shè)置為4個處理, 分別為不施肥[CK, 0 kg(N)?hm-2]、施低量氮肥(N2, 年施尿素氮135 kg?hm-2)、施高量氮肥(N4, 年施尿素氮270 kg?hm-2)和尿素氮肥與有機肥配施(M2N2, 其中尿素氮135 kg?hm-2; 有機肥為豬廄肥, 其中含純N 135 kg·hm-2)。小區(qū)面積為69 m2, 不同施肥處理3次重復(fù)。

土壤采集于2015年7月20日(玉米抽雄期), 采用對角線五點采樣法, 采集0~20 cm、20~40 cm和40~60 cm剖面深度的土壤。每個小區(qū)同一土層的土壤組成混合代表樣, 所取土壤去除雜物, 碾碎后混勻, 一部分用冰盒保存帶回實驗室后-80 ℃保存, 另一部分裝入自封袋帶回實驗室后4 ℃保存, 用鮮土樣測定硝化強度、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量, 剩余土壤自然風(fēng)干后測定土壤pH。

1.2 土壤理化指標(biāo)的測定

土壤pH測定采用電位法(土∶水=1∶2.5); 土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮用0.01 mol?L-1CaCl2浸提新鮮土樣后, 采用連續(xù)流動注射分析儀(AA3-HR, SEAL, Germany)測定; 硝化強度的測定參照趙爽等[11]的方法。

1.3 土壤微生物總DNA提取

土壤微生物DNA的提取采用E.Z.N.Z.TM Soil DNA Kit(OMEGA), 獲得DNA后用Qubit測定濃度, 并采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA質(zhì)量,-20 ℃保存。

1.4 細菌16S rDNA和AOB amoA 基因的熒光定量PCR

分別用引物515F/907R和A-1F/A-2R擴增細菌16S rDNA和AOBA基因, PCR體系為50mL, 分別含10×Buffer 5.0mL, dNTP(各2.5mmol×L-1) 4.0mL, 上下游引物(10mmol×L-1)各1.0mL, DNA模板(1~10 ng) 2mL, rTaq(5 U×mL-1)1.0mL, 最后用ddH2O補至50.0mL。PCR程序: 94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s, 53 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 45個循環(huán); 最后72 ℃延伸10 min。回收PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體, 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中, 經(jīng)Amp+、IPTG和X-gal的LB平板篩選陽性克隆, 測序分析。

標(biāo)準曲線的制作: 提取測序正確的細菌16S rDNA、AOBA基因的陽性克隆質(zhì)粒, 用Qubit測其濃度, 按10倍梯度稀釋質(zhì)粒成實時熒光定量PCR測定標(biāo)準品,-20 ℃保存。

熒光定量PCR在ABI 7500 StepOne Plus上進行, 反應(yīng)體系為20mL, 分別含GoTaq?qPCR Master Mix 10.0mL, 上下游引物各0.8mL(10mmol×L-1), DNA模板2.0mL(1~10 ng), 用ddH2O補至20.0mL。qPCR引物及程序如表1所示。

將稀釋100倍的土壤DNA樣品與標(biāo)準品一起進行Real-Time PCR檢測, 包括陰性對照在內(nèi)每個樣品設(shè)3個重復(fù)。細菌16S rDNA基因標(biāo)準曲線的2為0.99, 擴增效率為99.67%, AOB-A基因標(biāo)準曲線的2為0.993, 擴增效率為107.73%。

表1 細菌16S rDNA和氨氧化細菌(AOB)定量PCR擴增引物及反應(yīng)條件

1.5 氨氧化細菌16S rDNA的PCR擴增

利用巢式擴增方法擴增氨氧化細菌的V3區(qū)域, 反應(yīng)體系為25 μL, 其中模板1 μL、前后引物(20 mmol×L-1)各0.5 μL、2′Taq Master Mix 12.5 μL、DNA-Free Water 10.5 μL。共使用3對引物8F/1492R、CTO 189F/654R、341F/519R(表2), 其中CTO 189F/654R是針對-AOB的一對特異性較高的引物。最后得到的PCR產(chǎn)物約190 bp, 用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后可用于DGGE分析。

表2 用于PCR-DGGE的擴增引物及反應(yīng)程序

1.6 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

移取PCR產(chǎn)物15 μL進行DGGE分析, 變性劑梯度范圍為35%~55%, 聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(100%的變性劑為尿素7 mol×L-1和40%的去離子甲酰胺), 在1′TAE緩沖液中, 180 V、60 ℃緩沖液中電泳6 h。電泳后采用Gene Finder法進行染色。然后用Gel-Doc XR凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0數(shù)據(jù)處理軟件, 差異顯著性分析利用單因素方差分析(ANOVA)和多重比較法(Duncan); DGGE圖譜分析采用Quantity-One圖像分析軟件。土壤理化因子與氨氧化微生物群落特征相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。用Shannon多樣性指數(shù)()、均勻度(H)和豐富度()等評價AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性。采用CANOCO 4.5.1軟件(Microcomputer Power, Ithaca, USA)分析AOB群落結(jié)構(gòu)和土壤理化因子間的關(guān)系。多樣性指數(shù)計算公式為:=-∑(n/)ln(n/),H=/ln, 式中n為單一條帶的強度,為所有條帶的總強度,為每一泳道總的條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 長期不同施肥處理下土壤理化性質(zhì)的變化

不同施肥處理對棕壤理化性質(zhì)產(chǎn)生不同影響(表3)。與不施肥相比, 所有施肥處理均顯著降低了0~20 cm土壤的pH(4.55~5.47); 同時, 施加無機肥的N2和N4處理顯著降低40~60 cm土壤pH, 而施加有機肥的M2N2處理則表現(xiàn)出相反結(jié)果(<0.05)。同一施肥處理下, 0~20 cm土壤pH不同程度地低于其他土壤深度。土壤氮素含量表現(xiàn)為, 與不施肥相比, 所有施肥處理均可顯著增加土壤NH4+-N(0.51~5.30 mg·kg-1)和NO3--N (6.24~45.27 mg·kg-1)的含量(<0.05)。除N2處理外, 同一施肥處理中, 0~20 cm土壤銨態(tài)氮與硝態(tài)氮含量均不同程度高于其他土壤深度。N2處理在相同土壤深度下, 與CK處理間硝化強度無明顯差異, M2N2與N4處理可明顯增加表層土壤(0~20 cm)硝化強度。

2.2 長期不同施肥處理下土壤總細菌和AOB數(shù)量的變化

以16S rDNA和細菌A基因為靶標(biāo), 用熒光定量PCR測定土壤總細菌和AOB的數(shù)量。結(jié)果顯示, 不同施肥處理下土壤總細菌數(shù)量為4.30×109~7.27×1011拷貝數(shù)?g-1(干土)。與不施肥相比, 所有施肥處理均顯著降低了0~20 cm土壤細菌的數(shù)量; 各施肥處理間, 在相同土壤深度下, N4處理土壤細菌數(shù)量均不同程度地低于N2和M2N2處理。相同施肥處理下, M2N2土壤細菌數(shù)量在不同土層中差異不明顯, 其他處理均表現(xiàn)為40~60 cm土壤細菌數(shù)量均顯著低于0~20 cm土層(圖1)。

表3 不同施肥處理不同深度土壤理化性質(zhì)的變化

CK、N2、N4和M2N2分別為不施肥、施低量氮肥、施高量氮肥和有機無機肥配施處理。表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準誤差, 每列數(shù)據(jù)標(biāo)有不同字母表示Duncan檢測下差異顯著(<0.05)。CK: no fertilizer; N2: low N fertilizer; N4: high N fertilizer; M2N2: organic manure combined with chemical fertilizer. Data are mean ± standard deviation (=3). In each column, data marked with different letters are significantly different according to Duncan test (< 0.05).

土壤AOB的數(shù)量為1.31×105~9.65×105拷貝數(shù)?g-1(干土)。與不施肥相比, 低量氮肥處理N2顯著增加了不同深度土壤中AOB數(shù)量, 高量氮肥處理N4中AOB在20~40 cm土層迅速升高, 在0~20 cm和40~60 cm土層則顯著降低。有機無機肥配施處理(M2N2)對0~40 cm土壤中AOB無明顯影響, 卻顯著降低40~60 cm土層AOB數(shù)量(圖1)?？傮w上, 土壤施肥后, 細菌和氨氧化細菌主要分布在0~40 cm土層區(qū)域中。

土壤AOB與總細菌的數(shù)量比值為45.4~55.2。施肥總體上增加了二者的比值, 且無機氮肥對二者比值的增加不同程度地高于無機有機氮肥配施處理(M2N2), 該結(jié)果應(yīng)與增施氮肥后土壤細菌數(shù)量下降有關(guān)。

圖1 不同施肥處理下不同土層土壤細菌(A)和氨氧化細菌(AOB, B)基因豐度特征

CK、N2、N4和M2N2分別為不施肥、施低量氮肥、施高量氮肥和有機無機肥配施處理。圖中不同字母表示不同施肥處理不同土層間差異顯著(<0.05)。CK: no fertilizer; N2: low N fertilizer; N4: high N fertilizer; M2N2: organic manure combined with chemical fertilizer. Different letters above the bars indicate significant differences among different treatments at different soil depths based on protected LSD test (< 0.05).

2.3 長期不同施肥處理下土壤AOB細菌群落結(jié)構(gòu)的變化

2.3.1 DGGE圖譜

DGGE技術(shù)是研究微生物種群結(jié)構(gòu)的免培養(yǎng)手段之一, 盡管檢測通量有限, 且只能檢測生境中數(shù)量占優(yōu)勢的微生物種群, 該技術(shù)重現(xiàn)性強、檢測速度快、價格經(jīng)濟、結(jié)果直觀等特點, 使其一直被廣泛應(yīng)用于不同生境中微生物種群多樣性及空間分布檢測等相關(guān)領(lǐng)域[15-16]。不同施肥方式下土壤AOB群落結(jié)構(gòu)的DGGE圖譜見圖2A。不同處理土壤AOB群落結(jié)構(gòu)的DGGE圖譜在電泳條帶數(shù)目、強弱和遷移位置均存在一定程度的差異, 顯示出AOB對環(huán)境因子變化的響應(yīng)特征。與不施肥相比, 施肥處理土壤AOB的條帶數(shù)減少。圖中的共有條帶(8、14和19)說明不同施肥處理土壤存在共有的AOB類群, 但其亮度不同, 說明這些AOB可能通過數(shù)量改變來響應(yīng)環(huán)境的變化。條帶17、22只存在于不施肥(CK)處理土壤中, 而條帶9、10、18只存在于高量無機氮肥(N4)處理土壤中, 說明這些AOB類群對土壤中氮素變化較為敏感。聚類分析顯示(圖2B), 12個處理(施肥處理′土層)聚為兩大類群, N4處理單獨聚成一類, 且0~20 cm與20~40 cm土層土壤之間的相似性達71%, 說明施加高量無機氮肥可明顯改變土壤中AOB的群落結(jié)構(gòu)。另外, 所有供試處理0~20 cm與20~40 cm土層土壤明顯聚為一類, 說明AOB群落結(jié)構(gòu)在0~20 cm和20~40 cm土層較為相似, 但在深層土壤(40~60 cm)發(fā)生明顯變化。

圖2 不同施肥處理下不同土層土壤氨氧化細菌(AOB)16S rDNA基因PCR-DGGE電泳圖譜(A)和聚類分析(B)

CK、N2、N4和M2N2分別為不施肥、施低量氮肥、施高量氮肥和有機無機肥配施處理。L1、L2和L3分別代表0~20 cm、20~40 cm和40~60 cm土層。CK: no fertilizer; N2: low N fertilizer; N4: high N fertilizer; M2N2: organic manure combined with chemical fertilizer. L1, L2 and L3 represent soil depths of 0-20 cm, 20-40 cm and 40-60 cm, respectively.

2.3.2 多樣性指數(shù)

不同施肥處理下不同深度土壤AOB的Shannon多樣性指數(shù)()、均勻度(H)和豐富度()存在明顯差異(表4)。與不施肥相比, 施肥處理顯著降低了土壤中AOB的多樣性、均勻度和豐富度指數(shù)。不同施肥處理下AOB的Shannon多樣性指數(shù)()、均勻度(H)和豐富度()指數(shù)表現(xiàn)為: CK>N4>M2N2>N2。相同施肥處理下, 土壤中AOB多樣性()、均勻度(H)和豐富度()指數(shù)均在表土層0~20 cm最高。隨土壤深度增加, CK、N2和N4處理下各多樣性指數(shù)均表現(xiàn)出顯著降低的趨勢, M2N2處理處理下AOB多樣性指數(shù)則在不同土層中無明顯差異。供試土壤中, N2處理各土層AOB種群多樣性、均勻度和豐富度(40~60 cm層除外)指數(shù)均為最低, 而N4處理則不同程度地提高了20~40 cm土壤AOB的各多樣性指數(shù), 說明土壤施氮量可改變AOB在不同土層的分布情況。

表4 不同施肥處理下不同土層土壤氨氧化細菌(AOB)的Shannon多樣性指數(shù)(H)、均勻度(EH)和豐富度(S)

CK、N2、N4和M2N2分別為不施肥、施低量氮肥、施高量氮肥和有機無機肥配施處理。表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準誤差, 每列數(shù)據(jù)標(biāo)有不同字母表示Duncan檢測下差異顯著(<0.05)。CK: no fertilizer; N2: low N fertilizer; N4: high N fertilizer; M2N2: organic manure combined with chemical fertilizer. Data are mean ± standard deviation (=3). In each column, data marked with different letters are significantly different according to Duncan test (< 0.05).

2.4 長期不同施肥處理下土壤中AOB數(shù)量、豐度、群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析

如表5所示, 土壤硝態(tài)氮含量與細菌豐度呈極顯著負相關(guān)(=-0.586,<0.01), 銨態(tài)氮含量則與AOB豐度呈顯著正相關(guān)(=0.384,<0.05), 土壤pH與細菌呈顯著正相關(guān)(=0.341,<0.05), 與AOB呈顯著負相關(guān)(=-0.381,<0.05)。多樣性指數(shù)與理化因子的相關(guān)性分析表明, AOB種群多樣性指數(shù)()(=-0.403,<0.05)、均勻度指數(shù)(H)(=-0.447,<0.01)均與硝態(tài)氮呈顯著負相關(guān)。豐富度()與土壤銨態(tài)氮(=0.631,<0.01)呈極顯著正相關(guān), 與pH(=-0.376,<0.05)均呈顯著負相關(guān)。土壤細菌與氨氧化細菌均與硝化強度無明顯相關(guān)性。

表5 土壤理化因子與氨氧化細菌(AOB)群落間的相關(guān)性

LogA:A基因拷貝數(shù)的對數(shù); log16S rDNA: 16S rDNA基因拷貝數(shù)的對數(shù)。*和**分別表示<0.05和<0.01水平顯著相關(guān)。LogA: logarithm of number ofA gene copies; Log16S rDNA: logarithm of number of 16S rDNA copies. * and ** mean significant correlation at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

以不同施肥處理土壤 DGGE條帶作為響應(yīng)變量, 用土壤pH、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、硝化強度作為解釋變量進行冗余分析(RDA), 冗余分析中箭頭表示環(huán)境因子, 箭頭所處的象限表示環(huán)境因子與排序軸的正負相關(guān)性, 箭頭連線長度表示該環(huán)境因子與樣本分布相關(guān)程度的大小, 箭頭連線間的夾角, 代表環(huán)境因子間的相關(guān)程度(圖3)。排序軸特征值分別為: 0.156、0.110、0.078、0.061, 分別解釋了15.1%、11.0%、7.8%、6.1%的AOB的群落變化。硝態(tài)氮的影響高于其他環(huán)境因子, 從圖中可以看出土壤硝態(tài)氮(=0.027)是造成群落差異的主要因素。pH(=0.113)、銨態(tài)氮(=0.35)、硝化強度(=0.545),>0.05, 對AOB群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。

圖3 土壤氨氧化細菌與環(huán)境因子的冗余分析

1、2和3為不施肥處理的0~20 cm、20~40 cm和40~60 cm土層; 4、5和6為施低量氮肥N2的0~20 cm、20~40 cm和40~60 cm土層; 7、8和9為施高量氮肥處理的0~20 cm、20~40 cm和40~60 cm土層; 10、11和12為M2N2有機無機肥配施處理的0~20 cm、20~40 cm和40~60 cm土層。In the figure, 1, 2 and 3 indicate 0-20 cm, 20-40 cm and 40-60 cm soil layers of no fertilizer treatment, respectively. 4, 5 and 6 indicate 0-20 cm, 20-40 cm and 40-60 cm soil layers of low N fertilizer treatment, respectively. 7, 8 and 9 indicate 0-20 cm, 20-40 cm and 40-60 cm soil layers of high N fertilizer treatment, respectively. 10, 11 and 12 indicate 0-20 cm, 20-40 cm and 40-60 cm soil layers of organic manure combined with chemical fertilizer treatment, respectively.

3 討論

3.1 不同施肥處理及土壤深度變化對AOB數(shù)量的影響

通常認為, 土壤pH和肥料可影響土壤中AOB的數(shù)量, 土壤中氨氧化微生物數(shù)量與種群結(jié)構(gòu)直接影響著土壤氮素供應(yīng)狀況[2]。本研究中AOB數(shù)量為1.31×105~9.65×105拷貝數(shù)?g-1(干土), 與Chen等[2]研究長期施肥水稻土中AOB數(shù)量平均值為1.90×105拷貝數(shù)?g-1(干土)的結(jié)果相似, 相較于Liu等[8]在南方酸性土壤中AOB數(shù)量108拷貝數(shù)?g-1(干土)數(shù)量級低, 且總AOB數(shù)量與銨態(tài)氮呈顯著正相關(guān)。楊亞東等[17]與Wang等[18]指出, AOB適合在中性至堿性、氮素含量豐富的土壤中生存, AOB數(shù)量與土壤pH呈顯著負相關(guān)。研究中, 長期施肥導(dǎo)致土壤pH降低, 土壤呈酸性狀態(tài), 土壤pH與AOB數(shù)量呈顯著負相關(guān)。分析其原因可能是AOB在適應(yīng)長期施肥過程中, 耐酸型AOB數(shù)量增多。

通常情況下, NH3是微生物進行氨氧化作用的直接底物, NH4+則作為間接底物影響氨氧化微生物的種類和數(shù)量[1]。由于酸性土壤中NH4+解離出來的NH3較少, 從而抑制AOB的生長[19]。研究中, 高量無機氮肥(N4)處理下, 20~40 cm層土壤AOB數(shù)量明顯高于其他處理, 但土壤中NH4+含量卻小于1 mg·kg-1, 其可能原因應(yīng)是, 有些AOB不以NH4+作為惟一的底物, 而以有機化合物作為底物生長(根系分泌物)[20]; 另外, 土壤中存在未知的AOB, 其對NH4+有較高的親和力, 如在酸性土壤中占優(yōu)勢的亞硝化螺旋菌()[21]。

施肥過程中, 不同施肥方式帶入土壤中的物料不同, 并在灌溉等管理措施下, 使得不同深度土壤中微生物結(jié)構(gòu)與土壤性質(zhì)產(chǎn)生差異。李晨華等[22]研究新疆灰漠土發(fā)現(xiàn), 長期施肥可顯著增加表層(0~20 cm)甚至是深層(20~300 cm)土壤氨氧化微生物的相對豐度。Wang等[18]也發(fā)現(xiàn), 稻田土壤0~20 cm表土層中, AOB數(shù)量是20~80 cm土層的439倍。本研究也獲得了相似結(jié)果, 細菌和AOB主要分布在0~20 cm和20~40 cm土層區(qū)域, 其原因可能是長期施入的尿素氮隨降水等措施下移至深土層, 并作為底物, 刺激AOB的生長。另外, 李晨華等[23]在綠洲農(nóng)田土壤的研究指出, 氮肥可刺激表層土壤中AOB的生長,細菌細胞可隨降水運移至深土層。

3.2 不同施肥處理及土壤深度變化對AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響

由DGGE圖譜可知, 不同土層不同施肥處理之間AOB條帶存在明顯差異, 表明長期施肥處理顯著改變了土壤氨氧化細菌群落結(jié)構(gòu)特征。與CK相比, 所有施肥處理(N2、N4和M2N2)的AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性均有所降低, 該結(jié)果與Ai[6]和Chu等[24]研究結(jié)果一致。其中, M2N2處理在一定程度上可維持不同土層AOB多樣性指數(shù)。其原因可能是長期施氮肥降低土pH(表1), 導(dǎo)致AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性降低。施用有機肥可通過維持土壤pH, 進而穩(wěn)定AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性。另外, 由于施入土壤中的氮素不同, 氮素種類與含量的差異, 也可能是導(dǎo)致AOB在土壤中分布差異的原因[22]。

研究不同土層AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性表現(xiàn)為, 除M2N2處理外, 所有處理0~20 cm土層AOB多樣性指數(shù)顯著高于20~40 cm和40~60 cm土層, M2N2處理不同土壤深度差異不明顯。究其原因應(yīng)是, 0~20 cm土層中可利用資源較為豐富、氧氣相對充足, 微生物群落之間的競爭關(guān)系差, 所以對在數(shù)量上不占優(yōu)勢的功能群落影響較小, 致使多樣性指數(shù)較高。隨著土壤深度增加, 生態(tài)環(huán)境難以滿足土壤中AOB的生長需求, 微生物多樣性指數(shù)降低。有機肥配施方式有助于增加各土層中多種養(yǎng)分供應(yīng), AOB能夠很好地利用土壤中養(yǎng)分, 與其他種群競爭, 進而增加種群多樣性[25]。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明, 長期定位施肥可顯著降低0~20 cm土壤pH, 提高土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量, 土壤硝化強度則變化不明顯。土壤中AOB的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)多樣性受施肥方式顯著影響, 并表現(xiàn)出明顯的垂直分布特征。其中, 土壤中增施氮肥可提高AOB的豐度, 降低細菌豐度。土壤中AOB多樣性指數(shù)均在表土層(0~20 cm)最高, 增施氮肥則顯著降低AOB的多樣性。有機與無機肥配施不僅有助于改善土壤酸化現(xiàn)象, 并可穩(wěn)定不同深度土壤中AOB種群多樣性。長期施肥棕壤中, 硝態(tài)氮含量是影響AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性的重要因子。

[1] LI Y Y, CHAPMAN S J, NICOL G W, et al. Nitrification and nitrifiers in acidic soils[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2018, 116: 290–301

[2] CHEN X, ZHANG L M, SHEN J P, et al. Abundance and community structure of ammonia-oxidizing archaea and bacteria in an acid paddy soil[J]. Biology and Fertility of Soils, 2011, 47(3): 323–331

[3] WU Y C, LU L, WANG B Z, et al. Long-term field fertilization significantly alters community structure of ammonia-oxidizing bacteria rather than archaea in a paddy soil[J]. Soil Science Society of America Journal, 2011, 75(4): 1431–1439

[4] HAYATSU M, TAGO K, UCHIYAMA I, et al. An acid-tolerant ammonia-oxidizing γ-proteobacterium from soil[J]. The ISME Journal, 2017, 11(5): 1130–1141

[5] FAN F L, YANG Q B, LI Z J, et al. Impacts of organic and inorganic fertilizers on nitrification in a cold climate soil are linked to the bacterial ammonia oxidizer community[J]. Microbial Ecology, 2011, 62(4): 982–990

[6] AI C, LIANG G Q, SUN J W, et al. Different roles of rhizosphere effect and long-term fertilization in the activity and community structure of ammonia oxidizers in a calcareous fluvo-aquic soil[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2013, 57: 30–42

[7] KUMAR U, SHAHID M, TRIPATHI R, et al. Variation of functional diversity of soil microbial community in sub-humid tropical rice-rice cropping system under long-term organic and inorganic fertilization[J]. Ecological Indicators, 2017, 73: 536–543

[8] LIU H Y, LI J, ZHAO Y, et al. Ammonia oxidizers and nitrite-oxidizing bacteria respond differently to long-term manure application in four paddy soils of south of China[J]. Science of the Total Environment, 2018, 633: 641–648

[9] OUYANG Y, REEVE J R, NORTON J M. Soil enzyme activities and abundance of microbial functional genes involved in nitrogen transformations in an organic farming system[J]. Biology and Fertility of Soils, 2018, 54(4): 437–450

[10] ZHAO J, NI T, LI Y, et al. Responses of bacterial communities in arable soils in a rice-wheat cropping system to different fertilizer regimes and sampling times[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e85301

[11] 趙爽, 胡江, 沈其榮. 兩個水稻品種根際土壤細菌和氨氧化細菌的群落結(jié)構(gòu)差異[J]. 土壤學(xué)報, 2010, 47(5): 939–945 ZHAO S, HU J, SHEN Q R. Difference in community structure of bacteria and ammonia-oxidizing bacteria in rhizosphere between two different rice cultivars[J]. Acta Pedologica Sinica, 2010, 47(5): 939–945

[12] WANG L, LI T. Effects of seasonal temperature variation on nitrification, anammox process, and bacteria involved in a pilot-scale constructed wetland[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2015, 22(5): 3774–3783

[13] MA Y X, TAO W, LIU J, et al. Response of ammonia-oxidizing betaproteobacteria to short-term fertilization in a salt marsh in China[J]. Journal of Oceanology and Limnology, 2018, 36(2): 351–361

[14] FOTIDIS I A, TREU L, ANGELIDAKI I. Enriched ammonia-tolerant methanogenic cultures as bioaugmentation inocula in continuous biomethanation processes[J]. Journal of Cleaner Production, 2017, 166: 1305–1313

[15] 黃鑫, 楊弢, 吳昊, 等. 成都老官山漢墓出土竹簡飽水保存期間的細菌群落結(jié)構(gòu)[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2018, 24(3): 493–499 HUANG X, YANG T, WU H, et al. Bacterial community structure in waterlogged bamboo slips excavated from the Laoguanshan Han Dynasty Tomb of Chengdu[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2018, 24(3): 493–499

[16] GARCIAS-BONET N, ARRIETA J M, DE SANTANA C N, et al. Endophytic bacterial community of a Mediterranean marine angiosperm ()[J]. Frontiers in Microbiology, 2012, 3: 342

[17] 楊亞東, 張明才, 胡君蔚, 等. 施氮肥對華北平原土壤氨氧化細菌和古菌數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報, 2017, 37(11): 3636–3646 YANG Y D, ZHANG M C, HU J W, et al. Effects of nitrogen fertilizer application on abundance and community structure of ammonia oxidizing bacteria and archaea in a North China agricultural soil[J]. Acta Ecologica Sinica, 2017, 37(11): 3636–3646

[18] WANG J C, ZHANG L, LU Q, et al. Ammonia oxidizer abundance in paddy soil profile with different fertilizer regimes[J]. Applied Soil Ecology, 2014, 84: 38–44

[19] XIA W W, ZHANG C X, ZENG X W, et al. Autotrophic growth of nitrifying community in an agricultural soil[J]. The ISME Journal, 2011, 5(7): 1226–1236

[20] TAGO K, OKUBO T, SHIMOMURA Y, et al. Environmental factors shaping the community structure of ammonia-oxidizing bacteria and archaea in sugarcane field soil[J]. Microbes and environments, 2015, 30(1): 21–28

[21] YAO H Y, CAMPBELL C D, CHAPMAN S J, et al. Multi-factorial drivers of ammonia oxidizer communities: Evidence from a national soil survey[J]. Environmental Microbiology, 2013, 15(9): 2545–2556

[22] 李晨華, 張彩霞, 唐立松, 等. 長期施肥土壤微生物群落的剖面變化及其與土壤性質(zhì)的關(guān)系[J]. 微生物學(xué)報, 2014, 54(3): 319–329 ZHANG C H, ZHANG C X, TANG L S, et al. Effect of long-term fertilizing regime on soil microbial diversity and soil property[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2014, 54(3): 319–329

[23] 李晨華, 賈仲君, 唐立松, 等. 不同施肥模式對綠洲農(nóng)田土壤微生物群落豐度與酶活性的影響[J]. 土壤學(xué)報, 2012, 49(3): 567–574 LI C H, JIA Z J, TANG L S, et al. Effect of model of fertilization on microbial abundance and enzyme activity in oasis farmland soil[J]. Acta Pedologica Sinica, 2012, 49(3): 567–574

[24] CHU H Y, FUJII T, MORIMOTO S, et al. Community structure of ammonia-oxidizing bacteria under long-term application of mineral fertilizer and organic manure in a sandy loam soil[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(2): 485–491

[25] ZHANG Q, LIANG G Q, MYROLD D D, et al. Variable responses of ammonia oxidizers across soil particle-size fractions affect nitrification in a long-term fertilizer experiment[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 105: 25–36

Community characteristics of soil ammonia oxidizing bacteria after different fertilizer applications*

REN Lingling, LI Xiuling, LIU Lingzhi**

(College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University / National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources / Arable Land Conservation in Northeast China, Ministry of Agriculture, Shenyang 110866, China)

Studies about ammonia oxidizing bacteria (AOB) have mainly focused on the topsoil and little has remained known about community distribution in the subsoil. There therefore has remained the need to understand the impact of long-term fertilization on AOB abundance, community structure and vertical distribution in order to deepen the exploration of microbial mechanisms of nitrogen (N) transformation and to develop sound fertilization regimes for sustainable soil quality in the study area and beyond. Thus, a long-term (1987-2015) fertilization experiment was set up in the brown earth in Shenyang Agriculture University, Liaoning Province, China. Four treatments were set, no fertilizer (CK), low N fertilizer (N2), high N fertilizer (N4) and low N fertilizer plus organic mature (M2N2). Soil samples were collected at three different depths (0-20 cm, 20-40 cm and 40-60 cm). The soil physico-chemical properties, 16S rDNA and AOB-A gene abundance (real-time PCR, qPCR) and AOB community structure and diversity (denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE) were investigated. While soil pH decreased, the content of soil ammonium N (NH4+-N) increased by 70.5%–939.21% and that of nitrate N (NO3--N) by 253.20%–625.48% in the fertilization treatments over CK treatment. Also while soil pH increased, the contents of soil NH4+-N and NO3--N decreased with increasing soil depth, except for N2treatment. The results of qPCR showed that fertilization treatments increased AOB abundance, but decreased total bacterial abundance compared to CK treatment. AOBA gene abundance was generally higher at the 0–20 cm than at the 20-40 cm and 40-60 cm soil layers. AOB abundance peaked in the N4treatment, with 9.65×105copies per g dry soil. The Shannon diversity (), evenness (H) and richness () indexes of AOB from DGGE fingerprints responded increasingly significantly (< 0.05) to fertilization regimes and soil-fertilization interactions with increasing soil depth. Although the tested diversity indexes were highest in the surface soil (0-20 cm), N fertilizer treatments (N2, N4and M2N2) significantly reduced AOB diversity indexes. Based on cluster analysis of the DGGE fingerprints, AOB community structure in the soil varied with fertilization treatments and soil depth. Three soil depths of high N fertilizer (N4) treatment was grouped together clearly. For other treatments, it was grouped according to soil depth with no discernible difference in AOB community structure among CK, N2and M2N2treatments. The 0-20 cm and 20-40 cm deep soils under fertilizer treatments formed single cluster with no less than 57% similarity, while 40-60 cm soil layer formed another cluster. Redundant gradient analysis (RDA) further showed that NO3--N (= 0.027) was the key factor that shaped AOB community under different fertilization treatments. The results indicated that AOB number and community structure diversity after long-term fertilization significantly varied with fertilization treatment, and showed obvious vertical distribution characteristics. Compared with chemical fertilizer (N2and N4) application, organic manure plus chemical fertilizer (M2N2) more favorably improved soil pH and maintained AOB community diversity in the subsoil.

Brown soil; Fertilization regime; Nitrogen fertilizer; Ammonia oxidizing bacteria (AOB); Community structure; Soil depth

, E-mail: liulingzhi2006@163.com

S147.2

A

2096-6237(2019)01-0011-09

10.13930/j.cnki.cjea.180645

任靈玲, 李秀玲, 劉靈芝. 不同施肥方式下土壤氨氧化細菌的群落特征[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(中英文), 2019, 27(1): 11-19

REN L L, LI X L, LIU L Z. Community characteristics of soil ammonia oxidizing bacteria after different fertilizer applications[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2019, 27(1): 11-19

* 遼寧省高等學(xué)?；究蒲许椖?LSNZD201705)和國家自然科學(xué)基金項目(31101504)資助

劉靈芝, 主要研究方向為土壤微生物。E-mail: liulingzhi2006@163.com

任靈玲, 主要研究方向為農(nóng)業(yè)環(huán)境保護。E-mail: 1464697578@qq.com

2018-07-08

2018-09-30

Jul. 8, 2018;

Sep. 30, 2018

* This study was supported by the Basic Research Projects of Liaoning Higher Education Institutions (LSNZD201705) and the National Natural Science Foundation of China (31101504).