納米羥基磷灰石復(fù)合物治療骨缺損的研究進(jìn)展

孫浩遠(yuǎn)，宋科官

羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是脊椎動物骨骼和牙齒的主要無機(jī)礦物成分，由六方柱狀單晶構(gòu)成，分子式為Ca10(PO4)6(OH)2，微溶于純水，呈弱堿性（pH值7～9），易溶于酸而難溶于堿[1]。由于人工合成HA的超微結(jié)構(gòu)與人體骨組織相似且具有很好的生物相容性，因此成為骨科和牙科植入物的理想材料[2]。納米羥基磷灰石（nano hydroxyapatite，nHA）生物相容性更加優(yōu)異，同時具有一定的骨引導(dǎo)力，但機(jī)械性能低、脆性大、不耐疲勞等不足限制了nHA在臨床上的應(yīng)用[3]。因此，在骨組織工程研究中常選擇合適的材料與nHA進(jìn)行復(fù)合，用于修復(fù)骨腫瘤、外傷、感染等多種原因?qū)е碌墓侨睋p。針對這一骨科領(lǐng)域的熱點問題，本文對各類nHA復(fù)合人工骨材料的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 nHA-多糖類復(fù)合材料

1.1 nHA-殼聚糖復(fù)合材料

殼聚糖是一種由氨基葡萄糖和N-二氨基葡萄糖組成的線性多糖，具有（1-4）糖苷鍵，被作為抗菌材料、組織創(chuàng)傷愈合及再生材料廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域[4]。殼聚糖可根據(jù)不同需要制作成微球型、生物膜型及各種三維支架，具有優(yōu)良的成孔能力、陰離子結(jié)合能力、抗菌活性和生物降解性，但生物支撐性能欠佳[5-6]。

nHA與殼聚糖復(fù)合后可模擬正常骨組織的結(jié)構(gòu)，提高其生物力學(xué)性能。nHA-殼聚糖復(fù)合物的制備方法很多，最常用的是原位化學(xué)法[7]。Kong等[8]原位制備的nHA-殼聚糖支架孔隙率95%，孔徑20～60 μm，成孔能力和生物相容性良好；而該支架的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性約為純殼聚糖支架的6倍，抗壓能力則高出0.511 MPa。

研究顯示，nHA-殼聚糖復(fù)合材料在仿生過程中更易形成磷灰石，提示其具有較好的礦化活性，成骨水平也更高[9]。而在小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向成骨細(xì)胞分化的作用研究中，人們發(fā)現(xiàn)nHA-殼聚糖纖維支架有更好的MSCs附著和增殖功能，在無成骨培養(yǎng)基的情況下也可上調(diào)膠原蛋白Ⅰ、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Runt-related transcription factor，Runx）-2，ALP和骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）等成骨基因標(biāo)記物的表達(dá)水平[10]。

Zhang等[11]在兔節(jié)段性骨缺損中分別植入nHA-殼聚糖復(fù)合支架與純殼聚糖支架，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植入nHA-殼聚糖復(fù)合支架的成骨性能高于單純殼聚糖支架組。亦有研究表明，與純殼聚糖支架相比，nHA-殼聚糖復(fù)合支架不僅能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分泌更多的細(xì)胞基質(zhì)，提高骨鈣蛋白含量，植入鼠顱骨骨缺損模型后還能表現(xiàn)出良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性[12]。然而，盡管nHA-殼聚糖復(fù)合支架應(yīng)用于骨缺損修復(fù)潛力巨大，但仍需進(jìn)一步優(yōu)化其在生物降解性、骨傳導(dǎo)性等方面的功能，以便未來更適用于臨床。

1.2 其他nHA-殼聚糖復(fù)合材料

nHA還可與細(xì)菌纖維素結(jié)合，生物安全性及降解性良好，除可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖外，還具有一定的骨支撐能力[13]，但目前研究多停留在安全性及生物相容性方面，機(jī)械性能、結(jié)構(gòu)等研究尚嫌不足。除此之外，肝素、硫酸軟骨素等多糖復(fù)合物也可與nHA復(fù)合，以滿足骨缺損修復(fù)對人工骨替代材料的不同需求[14-15]。

2 nHA-蛋白質(zhì)類復(fù)合材料

2.1 nHA-膠原復(fù)合材料

2.1.1 生物學(xué)性能 膠原蛋白是骨骼的主要成分，具有直徑50～500 nm的纖維結(jié)構(gòu)，這種納米尺寸的膠原蛋白可影響細(xì)胞的附著、增殖和成骨能力。而nHA在骨組織中長約50 nm、寬約25 nm、厚2～5 nm，其在骨組織中的排列方向受到組織中膠原纖維分子的影響[16]，與膠原復(fù)合后可模仿天然骨的組成和結(jié)構(gòu)，是目前骨組織工程生物材料研究的熱點之一。此外，nHA-人樣膠原支架還具有均一的相互連接的大孔結(jié)構(gòu)，可承受（2.67±0.37）MPa的壓縮應(yīng)力，明顯高于人工骨[17]。

2.1.2 制備方法 nHA-膠原蛋白的主要制備方法是原位免疫法。對此法制備的由分層組裝膠原蛋白和nHA共同組成的納米復(fù)合物進(jìn)行觀測，可發(fā)現(xiàn)復(fù)合材料中的nHA顆粒尺寸約50～100 nm[18]。研究發(fā)現(xiàn)，使用1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺作為交聯(lián)劑，通過冷凍凝膠技術(shù)制成不同比例的膠原-nHA支架，其細(xì)胞增殖能力和機(jī)械強(qiáng)度也高于膠原支架[19]。

2.1.3 在骨修復(fù)研究中的應(yīng)用 體外研究證實了nHA膠原復(fù)合支架可提高M(jìn)SCs的黏附、增殖和分化能力[20]。Hayrapetyan等[21]制備的nHA-膠原復(fù)合物支架力學(xué)強(qiáng)度可達(dá)到天然松質(zhì)骨的下限（1 MPa），1周內(nèi)可觀察到成骨細(xì)胞在多孔復(fù)合支架上黏附、擴(kuò)散和增殖，提示該支架可明顯增強(qiáng)MSCs的成骨能力。有學(xué)者采用nHA-膠原復(fù)合物修復(fù)29例骨缺損，術(shù)后1～3個月X線片顯示nHA-膠原材料與缺損周圍骨組織界限模糊，3～6個月復(fù)合材料與骨組織融為一體，達(dá)到骨性連接[22]，提示nHA-膠原材料是治療四肢骨缺損的理想植骨填充材料之一。

2.2 nHA-明膠復(fù)合材料

明膠是一種半透明固體物質(zhì)，含有明膠的nHA是骨組織工程研究的重要復(fù)合材料之一[23]。殷海榮等[24]采用濕法共沉淀制備nHA-明膠復(fù)合物，在其中加入戊二酸對明膠進(jìn)行交聯(lián)，對復(fù)合材料進(jìn)行超聲處理，既可避免明膠過早降解，又能提高復(fù)合物的拉伸強(qiáng)度和抗壓強(qiáng)度（分別為66.4 MPa、67.8 MPa）。Azami等[25]制備合成孔徑在300～500 μm之間的nHA-明膠復(fù)合材料,以明膠滴為微反應(yīng)器，在膠體保護(hù)介質(zhì)的油包水乳液中合成nHA-明膠微粒，其中可觀察到針狀nHA晶體，制備的微球平均粒徑7.5 μm，粒徑分布窄，分散度高，形成天然多孔結(jié)構(gòu)。

體外試驗則證實，nHA-明膠復(fù)合材料生物相容性良好，具有修復(fù)骨缺損的合適結(jié)構(gòu)，可用于制作骨組織工程支架[26-27]。但其力學(xué)性能較差，通常需要與其他材料進(jìn)行交聯(lián)制備，nHA、明膠、聚乙烯醇三者混合制備可大大提高nHA復(fù)合材料的強(qiáng)度[28]。

2.3 nHA-絲素蛋白復(fù)合材料

絲素蛋白（silk fibroin，SF）因其優(yōu)越的生物降解性、良好的生物相容性和極其輕微的炎癥反應(yīng)而在骨組織工程研究中深受關(guān)注[29-30]。有研究表明，采用冷凍干燥技術(shù)制備的nHA-SF支架其抗壓強(qiáng)度明顯增大，為2.0～3.2 MPa，而以共沉淀法制備的直徑約10 nm、晶體長度為50～80 nm的針狀nHA在多孔nHA-SF支架中分布均勻[31]。

孫慶治[32]采用冷凍干燥技術(shù)制備nHA-SF支架，植入兔股骨骨缺損模型后12周，影像學(xué)檢查提示植入支架完全降解，骨缺損被新生骨組織取代，因此肯定了nHA-SF支架的生物降解能力及成骨能力。Wei等[33]以電紡絲技術(shù)為基礎(chǔ)并采用鈣-磷交替浸泡法制備的nHA-SF支架和純絲素支架上培養(yǎng)成骨細(xì)胞，在培養(yǎng)第7 d后通過檢測ALP的活性提示nHA-SF支架可顯著提高成骨細(xì)胞活性。

3 nHA-高分子聚合物復(fù)合材料

3.1 nHA-聚酯類復(fù)合材料

3.1.1 nHA-聚乳酸復(fù)合材料 聚乳酸（polylactic acid，PLA）因其良好的生物降解性、生物相容性和熱塑性，成為骨組織工程中應(yīng)用最廣泛的合成聚合物之一，nHA與PLA材料復(fù)合后具備了骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性和抗壓縮力學(xué)性能。黃江鴻等[34]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)nHA-PLA復(fù)合物中nHA含量為20%時，該復(fù)合物具有更優(yōu)的力學(xué)性能和降解性能。

眾所周知，骨缺損替代材料不僅要考慮其骨誘導(dǎo)能力，材料本身的機(jī)械強(qiáng)度也至關(guān)重要。針對這一點，目前主要采用誘導(dǎo)相分離技術(shù)和不同的分散方法（機(jī)械攪拌法、原位沉淀法和超聲波法、原位聚合法和熔融共混法）制備nHA-PLA復(fù)合支架[35]。由棒狀nHA顆粒通過熱誘導(dǎo)相分離法制備而成的nHA-PLA復(fù)合支架，其平均尺寸可達(dá)到長100～400 nm、寬37～65 nm，力學(xué)性能明顯改善[36]。Hong等[37]運用冷凍干燥及交聯(lián)法制備nHA含量為4%的PLA復(fù)合材料，拉伸強(qiáng)度、彎曲強(qiáng)度和沖擊強(qiáng)度均得到提升。而采用熱誘導(dǎo)相分離法制備的多孔nHA-膠原-PLA-殼聚糖微球復(fù)合支架，隨著微球中nHA含量從0%增加到50%，其抗壓強(qiáng)度從1.42 MPa提高到1.63 MPa，壓縮模量從15.4 MPa提高到25.5 MPa[38]。

其他常用的制備方法還有以下幾種。Nejati等[39]采用固液分離法制備nHA/PLA復(fù)合材料支架，孔隙率高達(dá)85%，孔徑64～175 μm，抗壓強(qiáng)度8.46 MPa，而單純由PLA制成的微復(fù)合支架抗壓強(qiáng)度只有1.79 MPa。Zhang等[40]運用噴氣紡紗法制備nHA-PLA納米復(fù)合材料，當(dāng)nHA含量為20%時，其抗壓強(qiáng)度和楊氏模量分別為155 MPa和3.6 GPa，支架上mc3t3成骨細(xì)胞的生長和增殖速度均高于普通PLA支架。采用微光固化法制備nHA-PLA復(fù)合樹脂，則是將不同量的nHA粉體和液體光引發(fā)劑混合到光交聯(lián)聚二丙烯酸酯樹脂中，隨著nHA含量的增加，復(fù)合nHA-PLA網(wǎng)絡(luò)材料的彈性模量隨之增大[41]。亦有研究顯示，通過共混法制備的nHA殼聚糖-PLA復(fù)合材料，其中nHA含量為60%～67%時，材料的抗壓強(qiáng)度高達(dá)160 MPa，nHA的加入提高了支架材料的壓縮力學(xué)性能[42]。

采用噴氣紡絲制備nHA-PLA三維復(fù)合納米纖維支架，將該支架應(yīng)用于體外培養(yǎng)MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞，提示其具有良好的細(xì)胞依附能力[43]。而3D打印nHA-PLA復(fù)合支架在兔骨缺損模型中的應(yīng)用結(jié)果則表明，該復(fù)合支架具有增強(qiáng)骨生成和體內(nèi)骨傳導(dǎo)的功能[44]。

盡管nHA-PLA材料在骨組織工程研究中應(yīng)用廣泛，但目前缺少橫向比較，無法明確制備技術(shù)及nHA、PLA配比量對nHA-PLA復(fù)合物整體性能的影響，這也是未來研究的一個主要方向。

3.1.2 nHA-聚己內(nèi)酯復(fù)合材料 聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）是一種在骨與軟骨領(lǐng)域非常有前景的生物可吸收聚合物，其性質(zhì)穩(wěn)定，價格低廉。目前PCL基聚合物和陶瓷納米復(fù)合材料的相關(guān)研究是骨組織工程領(lǐng)域的一大熱點[45]。然而，PCL存在的生物活性問題導(dǎo)致新的骨組織無法與聚合物表面緊密結(jié)合。Heo等[46]采用改良快速成型方法制備nHA-PCL和mHA（micro hydroxyapatite）-PCL支架，其尺寸范圍分別為20～90 nm和20～80 μm，其中nHA支架具有良好的連通性，孔隙率為72%～73%，孔徑為500 μm。而對PCL-nHA復(fù)合材料斷裂表面的觀察則顯示，nHA在PCL基體中分散良好，分布均勻；力學(xué)測試結(jié)果表明，與單純的PCL相比，PCL-nHA復(fù)合材料的楊氏模量和壓縮模量都有所提高，nHA含量在復(fù)合物中達(dá)到50%時，可使該復(fù)合材料楊氏模量從193 MPa增加到665 MPa，壓縮模數(shù)從230 MPa增加到487 MPa[47]。

nHA-PCL能夠支持MSCs的生長并引導(dǎo)MSCs成骨分化，在復(fù)合納米纖維上培養(yǎng)BMSCs時nHA與PCL納米纖維結(jié)合并不會影響細(xì)胞活力，礦物相的存在還提高了成骨細(xì)胞相關(guān)基因（如Runx-2和骨唾液蛋白）的ALP活性和mRNA表達(dá)水平[48]。而采用單層電紡支架制備nHA-PCL纖維支架，在該支架上培養(yǎng)成骨細(xì)胞，細(xì)胞礦化和ALP活性與對照組相比均有不同程度的提高[49]。上述基礎(chǔ)研究提示，nHA-PCL不僅在機(jī)械性能上滿足了植骨需求，而且能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化能力，是一種理想的骨填充材料。

3.1.3 nHA-聚乳酸-聚乙醇酸復(fù)合材料 聚乳酸-聚乙醇酸[poly(lactic-co-glycolic)acid，PLGA]是一種可生物降解的共聚物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)用植入物和藥物控釋方面[50]。通過選擇性激光燒結(jié)法制備PLGA-nHA復(fù)合多孔支架，隨著nHA含量從0%增加到20%，支架的抗壓強(qiáng)度從1.82 MPa提高到3.28 MPa，模量從22.75 MPa提高到32.81 MPa[51]。采用靜電紡絲法制備含有nHA的PLGA纖維復(fù)合支架，其平均直徑為（266.6±73）nm；nHA-PLGA復(fù)合條帶則可采用溶劑澆鑄法、氣體發(fā)泡和顆粒浸出法制備，無需使用有機(jī)溶劑[52-53]。

有研究表明，按不同比例復(fù)合nHA與PLGA，所制備的支架材料對骨細(xì)胞的誘導(dǎo)能力有所不同，將兩種配比的nHA-PLGA（20/80和50/50）微球基復(fù)合支架植入兔股骨骨缺損模型中，8周后可發(fā)現(xiàn)，nHA-PLGA（20/80）較nHA-PLGA（50/50）有更好的成骨作用，提示制備復(fù)合支架時應(yīng)考慮nHA-PLGA復(fù)合材料中nHA的濃度，其對復(fù)合材料的生物相容性、降解速率和骨傳導(dǎo)性均有重要影響[54]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在采用相轉(zhuǎn)化法制備nHA-PLGA復(fù)合材料的過程中，當(dāng)nHA含量達(dá)30%時，復(fù)合物具有良好的理化性能，能增強(qiáng)體外礦化作用，促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和誘導(dǎo)分化，治療骨組織缺損再生效果良好[55]。但有關(guān)nHA-PLGA復(fù)合時能最大化成骨的具體配比，目前仍不明確。

3.2 nHA-聚酰胺復(fù)合材料

聚酰胺（polyamide，PA）與人骨天然膠原結(jié)構(gòu)和分子具有相似性，有良好的力學(xué)性能、生物可降解性，且無毒性。Wei等[56]采用共溶共沉淀法制備針狀nHA-PA生物復(fù)合材料，nHA晶體可在復(fù)合材料中均勻分布（晶體直徑為10～20 nm、長度為70～90 nm），復(fù)合材料孔隙率為80%，彈性模量為5.6 GPa，與天然骨相似，而生物陶瓷和醫(yī)用金屬的彈性模量則遠(yuǎn)高于天然骨。亦有研究表明，利用熱誘導(dǎo)相變處理技術(shù)制備nHA-PA復(fù)合支架，引入MSCs后可極大程度地提高骨形成效率[57]。

研究者將通過注射成型法制備好的nHAPA66復(fù)合支架材料植入16只新西蘭白兔的肌肉和脛骨中，2周后在多孔復(fù)合材料中檢測到成骨，12周時新骨形成密度與周圍宿主骨相似，提示復(fù)合材料誘導(dǎo)形成的新骨此時已達(dá)到正常骨質(zhì)量[58]。在臨床中采用nHA-PA66復(fù)合材料填充骨巨細(xì)胞瘤刮除術(shù)后遺留的骨缺損，隨訪結(jié)果表明術(shù)后1年植骨區(qū)骨密度接近正常骨密度，植骨材料與新生骨及周圍組織結(jié)合緊密[59]。也正是由于nHA-PA材料具有良好的生物安全性、組織相容性以及優(yōu)異的骨傳導(dǎo)性和成骨活性，因此，其在臨床骨缺損修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊。

3.3 nHA-其他高分子聚合物復(fù)合材料

有學(xué)者通過熔融共混復(fù)合等工藝制備nHA-高密度聚乙烯復(fù)合人工骨材料，機(jī)械力學(xué)性能優(yōu)異，可提高nHA的力學(xué)強(qiáng)度及韌性[60]。馮偉等[61]在兔節(jié)段性骨缺損模型中植入nHA-聚羥基磷酸戊酯/聚乙二醇復(fù)合材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組生成新骨的強(qiáng)度明顯高于單純nHA骨缺損植入對照組，成骨能力良好。但此類材料目前多處于合成研究階段，體內(nèi)試驗研究較少，安全性、穩(wěn)定性及成骨性能均有待進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)與展望

nHA基復(fù)合材料是一種應(yīng)用前景良好的骨組織工程生物材料，目前在骨缺損領(lǐng)域研究較多的是與殼聚糖、膠原、明膠、SF、PLA、PCL、PA等復(fù)合，這些材料與nHA復(fù)合后具有一定的機(jī)械支撐及成骨能力，但仍不能完全克服材料自身的缺點，因此目前有學(xué)者將關(guān)注點聚焦于nHA與多種材料的有效復(fù)合研究上，如在nHA-明膠微球中包埋基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、nHA和FeO納米顆粒復(fù)合到殼聚糖/膠原（CS/COL）有機(jī)基質(zhì)中制備磁性支架等[62-63]。nHA還可與無機(jī)材料及其眾多細(xì)胞因子（轉(zhuǎn)化生長因子β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、人成骨蛋白、成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等）結(jié)合以增強(qiáng)其成骨能力，滿足臨床修復(fù)骨缺損的各種需求[64-68]。此外，nHA基聚合物復(fù)合材料的細(xì)胞-材料相互作用、機(jī)械強(qiáng)度、生物性能及生物醫(yī)學(xué)意義，也是未來的研究方向之一。