S100A4參與類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的研究進展

徐武巖，查丁勝，吳 昊，陽 華，林宏生，查振剛

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫性疾病，先天免疫系統(tǒng)的炎癥細胞（包括單核細胞、巨噬細胞等）產(chǎn)生各種促炎細胞因子浸潤滑膜，引起滑膜炎癥。RA的標志就是滑膜增生、血管生成增加以及細胞因子和包括基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteases，MMPs）在內(nèi)的各類蛋白水解酶的上調(diào)。

S100鈣結(jié)合蛋白A4（S100 calcium-binding protein,S100A4）最初從嚙齒類動物腫瘤細胞中分離出來，隨后在轉(zhuǎn)基因動物模型中發(fā)現(xiàn)其過度表達與癌癥進展相關(guān)[1]。最近在增殖的RA成纖維樣滑膜細胞（rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RAFLSs）和RA患者的滑膜組織中發(fā)現(xiàn)S100A4 mRNA表達增加，而RAFLSs具有以類似腫瘤的方式增殖和侵入周圍組織的能力，在骨與軟骨的破壞過程中發(fā)揮作用[2]。因此，學者們推測S100A4可能有助于RA滑膜發(fā)生侵襲性和類腫瘤樣行為[3]。

鑒于目前RA的病因及發(fā)病機制尚不明確，預(yù)防及早期診斷幾無可能。因此，尋找定期監(jiān)測疾病活動及評估預(yù)后的生物標志物尤為重要，不僅為早期RA患者提供分級與個體化治療，也為全面理解RA發(fā)病機制提供依據(jù)；有效監(jiān)測疾病活動還可降低長期過度治療的風險，這些風險包括免疫抑制藥物對患者的潛在毒性、掩蓋其他亞臨床疾病的進展等。本文旨在綜述S100A4參與RA發(fā)病機制的相關(guān)研究進展，以期為RA的早期預(yù)防、診斷、治療及特異性藥物的開發(fā)提供參考。

1 S100A4的生物學功能

S100蛋白是一個酸性Ca2+結(jié)合蛋白家族，包含20多個成員。其與鈣離子結(jié)合后蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出與靶蛋白結(jié)合的位點，進而通過相應(yīng)的靶蛋白發(fā)揮其生物學效應(yīng)。S100蛋白參與調(diào)節(jié)多種生物功能，胞內(nèi)功能包括鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、蛋白磷酸化、細胞骨架重排、轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控以及通過各種模式識別受體誘發(fā)炎性反應(yīng)；胞外功能則是通過晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGEs）及 toll樣受體 4（toll-like receptor 4，TLR4）調(diào)節(jié)細胞的增殖、活化及凋亡[4]。

S100A4是低分子量（9-13kDa）的S100蛋白家族成員之一，在癌癥發(fā)展中的作用目前被廣泛研究，其與病變轉(zhuǎn)移灶的緊密結(jié)合有力證實了該蛋白與癌細胞遷移的相關(guān)性[5]。多種人類腫瘤表達S100A4，這對癌癥患者的分期和預(yù)后具有潛在的預(yù)測價值[6]。Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn)S100A4在不同病理類型的肺癌中都有過度表達，而抑制非小細胞肺癌中S100A4表達后可明顯降低腫瘤細胞的增殖速度及侵襲能力，推測S100A4可通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖來控制肺癌發(fā)展。Destek和Gul[8]對148例結(jié)直腸癌患者的病理切片進行免疫組化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中132例（89%）患者S100A4表達陽性，細胞質(zhì)S100A4的表達水平與結(jié)直腸癌TNM分期以及患者的存活率顯著相關(guān)。亦有學者指出，S100A4與多種細胞內(nèi)靶蛋白如細胞骨架成分、E-鈣黏蛋白、p53及MMPs的調(diào)節(jié)有關(guān)，它們共同構(gòu)成病灶轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)，這也進一步揭示了S100A4在細胞運動、黏附、分離、增殖和凋亡中的作用；與此同時，該蛋白還參與細胞外基質(zhì)的血管生成和重塑，通過對血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的活化直接促進血管生成，加速滑膜血管翳的形成[9]。

2 體外研究揭示S100A4參與RA發(fā)生發(fā)展的分子機制

諸多體外研究從分子水平揭示，S100A4可通過參與刺激細胞增殖、調(diào)節(jié)細胞凋亡和組織重塑以及促進血管翳形成過程，引起RA炎癥和組織破壞，加速RA的發(fā)生發(fā)展。

2.1 S100A4與細胞凋亡、炎癥反應(yīng)

有學者認為，細胞外S100A4可穩(wěn)定RAFLSs中的p53腫瘤抑制因子，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄激活并影響p53靶向基因（包括Bcl-2、p21WAF和Hdm-2）以及MMPs的表達，而S100A4蛋白與野生型p53蛋白的螯合，可加速野生型p53功能的喪失，以致細胞周期失去調(diào)控，抑制細胞凋亡[10]。Cerezo等[11]的研究亦證實，S100A4通過刺激外周血單核細胞，顯著提高白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和TNF-α的表達，進而誘導單核細胞中TLR4介導的炎癥反應(yīng)，激活轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor，NF）-κB、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）1/2和p38；S100A4多聚體（活性形式）還可刺激滑膜成纖維細胞，參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)過程。這些結(jié)果均支持S100A4參與激活免疫介導的疾?。ㄈ鏡A）中的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的假設(shè)。

2.2 S100A4與細胞增殖、基質(zhì)降解

細胞異常增殖目前被認為是RA滑膜生長的主要機制。RAFLSs具有轉(zhuǎn)化細胞的特征，在連續(xù)培養(yǎng)中表現(xiàn)出高增殖率、接觸抑制缺失、組成性表達細胞因子mRNA和錨定非依賴性細胞生長等一些新特性[12]。有實驗證實p53基因在滑膜中的累積及其對RAFLSs增殖調(diào)控的重要作用[13]；Grigorian等[14]進一步指出，S100A4蛋白可與p53蛋白C終端調(diào)控區(qū)結(jié)合，通過蛋白激酶C的作用抑制p53蛋白磷酸化，從而使p53蛋白喪失細胞周期調(diào)控作用及其在G1/S期的檢查點功能，令DNA易發(fā)生突變的細胞進入S期，引起RAFLSs的侵襲性生長。亦有研究發(fā)現(xiàn)，S100A4可能通過與細胞內(nèi)靶蛋白如腫瘤抑制因子p53的相互作用引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，進而參與RAFLSs的侵襲性生長過程。柏干蘋等[15]、Bo等[16]應(yīng)用固相pH梯度雙向凝膠電泳技術(shù)分離RA患者和正常人RAFLSs中的差異蛋白，成功鑒定異常表達的S100A4，并用Western Blot免疫細胞化學技術(shù)再次驗證；光鏡下正常成纖維樣滑膜細胞中的S100A4只在細胞漿表達，但在RAFLSs中其分布發(fā)生變化，細胞漿和細胞核均可見熒光分布，且細胞核中明顯較多，提示S100A4在RAFLSs中高表達，且與RAFLSs表型改變及其侵襲性生長密切相關(guān)。Schmidt-Hansen等[17]的研究亦發(fā)現(xiàn)，胞外S100A4可促進小鼠內(nèi)皮細胞中p53的表達，影響包括MMPs在內(nèi)的p53靶向基因的調(diào)節(jié)，導致抑制劑E-鈣黏蛋白表達下調(diào)，無法正常介導同型細胞間的黏附，進而刺激小鼠內(nèi)皮細胞的浸潤性生長。此外，S100A4還可刺激原癌基因PIM-1在RAFLSs高表達，而PIM-1是某些非血液腫瘤細胞增殖和侵襲的主要調(diào)節(jié)因子，這也是RAFLSs具有高度侵襲性的重要原因[18]。

細胞外基質(zhì)的降解是細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，MMPs可通過降解細胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分來破壞組織學屏障。S100A4通過與人類軟骨細胞中的活化NF-κB相結(jié)合，激活RAGEs通路，增強 MMP-13 的表達[19]；Senolt等[20]的研究結(jié)果則表明，S100A4可促進炎癥細胞因子（IL-1β、TNF-α等）在RAFLSs中表達并觸發(fā)細胞內(nèi)外信號通路，上調(diào)MMP-3 mRNA，誘導MMP-3蛋白的釋放，MMP-1、MMP-9和MMP-13 mRNA在滑膜中的表達也同時上調(diào)。而鑒于MMPs對RA關(guān)節(jié)明顯的破壞作用，學者們認為S100A4參與了包括血管翳形成和關(guān)節(jié)軟骨破壞等在內(nèi)的RA發(fā)病機制。

2.3 S100A4與新生血管形成

新生血管形成被認為是生成和維持RA血管翳的一個重要因素，而VEGF是新生血管形成的關(guān)鍵調(diào)控因素[21]，也是RA發(fā)病過程中的直接促炎細胞因子。Hernández等[22]研究發(fā)現(xiàn)，S100A4通過RAGEs與VEGF協(xié)同作用，增強MMP-9活性，促進內(nèi)皮細胞遷移；而阻斷由S100A4和VEGF結(jié)合誘導的內(nèi)皮細胞遷移后，血管生成被有效抑制。在我們的體外細胞模型實驗中，S100A4可通過mTORC1信號通路下游蛋白S6信號通路途徑，增強RAFLSs中VEGF的活性及蛋白表達，間接促進S100A4在體外形成血管的作用[23]。

3 在體研究證實S100A4在RA發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色

構(gòu)建動物模型在RA研究中是不可或缺的手段。目前關(guān)節(jié)炎動物模型的構(gòu)建技術(shù)已相對成熟，應(yīng)用最廣泛的動物模型包括Ⅱ型膠原誘導的關(guān)節(jié)炎模型和佐劑誘導的關(guān)節(jié)炎模型等，是研究RA發(fā)病機制的良好媒介。

柏干蘋等[24]報道，注射S100A4 siRNA后佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠（模型干擾組）關(guān)節(jié)炎性腫脹明顯改善，關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯降低，炎性細胞浸潤及滑膜增生現(xiàn)象減輕，血清TNF-α、IL-1β和VEGF表達水平低于模型組，關(guān)節(jié)滑膜的病理損傷明顯減輕，這一結(jié)果提示S100A4在滑膜異常增殖及關(guān)節(jié)炎癥進展中可能發(fā)揮重要作用。

在Nishioku等[25]的研究中，通過構(gòu)建Ⅱ型膠原誘導的CIA小鼠模型，作者發(fā)現(xiàn)S100A4借助p53來下調(diào)緊密結(jié)合蛋白occludin的表達水平，增加小鼠RAFLSs的細胞旁通透性，這也部分解釋了RAFLSs高度侵襲性的原因。也有學者在缺乏S100A4蛋白（S100A4KO）的甲基化牛血清白蛋白（methylated bovine serum albumin，mBSA）免疫小鼠以及用靶向S100A4-shRNA構(gòu)建體處理的野生型對照小鼠中誘導關(guān)節(jié)炎，并對關(guān)節(jié)炎的嚴重程度進行形態(tài)學評估，結(jié)果表明，S100A4KO小鼠關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損傷的形態(tài)學征象明顯減輕；進一步的體外實驗顯示S100A4可直接結(jié)合Src家族中的Lck和Fyn，并增強它們在CD5細胞結(jié)構(gòu)域的激酶活性，進而控制Th17細胞的CD5依賴性分化，從而在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[26]?？傊?，這些研究結(jié)果進一步證實S100A4參與了高度侵襲性的RAFLSs的異常增殖，而抑制S100A4的功能和表達對RA有一定的治療效果。

4 S100A4異常表達在RA臨床研究中具有重要價值

4.1 預(yù)測RA患者疾病轉(zhuǎn)歸和療效的有效指標

由于S100A4水平與治療效果關(guān)系密切，因此有望成為評估RA患者預(yù)后的指標之一[27]。Erlandsson等[28]根據(jù)血清S100A4水平將87例RA患者分為3組，對比影像學表現(xiàn)、Flt3配體含量及疾病轉(zhuǎn)歸后發(fā)現(xiàn)，S100A4水平與RA患者影像學損害程度相關(guān)，高水平表達的S100A4會導致英夫利昔單抗治療效果不佳；進一步剔除年齡、性別、病程等混雜因素后，S100A4水平與緩解率仍呈負相關(guān)；同時，S100A4水平與原癌基因survivin、Flt3配體水平也密切相關(guān)，提示3種蛋白可能共同構(gòu)成一個預(yù)測RA的生物標記物。在Ha等[18]的研究中，S100A4水平與原癌基因PIM-1水平呈正相關(guān)，而PIM-1減少可有效抑制RAFLSs的體外增殖、遷移以及MMPs的產(chǎn)生，有效改善患者預(yù)后，這也預(yù)示著低水平S100A4的RA患者可能預(yù)后更好。

4.2 評估RA患者疾病活動程度的生物學標志

TNF-α抑制劑英夫利昔單抗是緩解RA的有效方法之一[29]。Oslejsková等[30]在40例抗TNF-α初治RA患者中隨機選取25例給予阿達木單抗治療，治療12周后患者疾病活動度明顯降低，S100A4的構(gòu)象從多聚體形式變?yōu)槎垠w形式，但蛋白總水平保持不變，由于多聚體被認為具有生物活性，因此推測生物活性S100A4蛋白（多聚體）的下調(diào)可能與TNF-α阻斷治療后疾病活動性降低有關(guān)。多聚體形式有利于S100A4蛋白表面鈣離子結(jié)合位點的顯露以及同其他功能蛋白之間的相互作用，以多聚體形式存在于細胞間質(zhì)中的S100A4蛋白正是細胞之間信號傳導，細胞與細胞基質(zhì)相互聯(lián)系、相互作用的基礎(chǔ)。Klingelh?fer等[10]也發(fā)現(xiàn)，RA和OA患者的胞外S100A4以不同構(gòu)象形式存在，RA患者的大部分胞外S100A4以多聚體形式存在，OA患者則大部分為S100A4二聚體，這與Oslejsková等[30]的研究結(jié)果相一致。為證實S100A4水平與疾病活動性的相關(guān)關(guān)系，有學者檢測早期RA組和健康對照組的S100A4水平，多變量回歸分析結(jié)果表明，早期RA組血清S100A4水平顯著高于健康對照組，治療3個月后明顯降低[31]。可見，通過檢測S100A4水平及其存在形式，可以有效判斷RA的活動程度。

4.3 其他作用

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，S100A4蛋白在RA患者膝關(guān)節(jié)滑膜中高表達，體外可促進RAFLSs分泌VEGF刺激滑膜血管生成，間接促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）形成管腔，這一結(jié)果提示S100A4可能是RA患者滑膜組織炎癥反復(fù)發(fā)作的一種新的致病因素[32]。其作用機制可能是，S100A4蛋白被表皮生長因子、成纖維生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等胞外生長因子激活后，促進了MMPs的表達和活化，而包括纖溶酶和MMPs在內(nèi)的水解蛋白酶又可釋放細胞外基質(zhì)中的TGF-β前體蛋白和FGF并進行活化，從而使S100A4表達水平進一步上調(diào)，由此建立一個正反饋調(diào)節(jié)機制，導致RA患者炎癥反復(fù)發(fā)作。

5 小結(jié)

目前有關(guān)腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移機制的研究已有很大進展，普遍認為是通過蛋白質(zhì)與多種效應(yīng)物的相互作用激活了信號通路，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的分離、黏附、運動、血管生成、細胞增殖和凋亡，進而增強了腫瘤細胞的侵襲性，促進腫瘤轉(zhuǎn)移。無獨有偶，腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移特征與RAFLSs在RA中的侵襲行為類似[33-34]。當前的體外研究和在體實驗結(jié)果證實，S100A4蛋白可穩(wěn)定RAFLSs中的p53腫瘤抑制因子，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄激活并影響p53靶向基因以及MMPs的釋放。一旦釋放至胞外，S100A4還可作為促炎因子，通過模式識別受體作用于炎癥部位，影響炎癥因子的分泌，參與調(diào)節(jié)細胞凋亡、組織重塑及刺激細胞增殖，進而導致RA炎癥、滑膜增生和組織破壞；S100A4還可通過增加VEGF表達來促進新生血管生成，參與滑膜血管翳的發(fā)生。臨床研究方面，S100A4在RA患者的滑膜組織和體液中高表達，其血清水平及構(gòu)象與RA發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。這些臨床證據(jù)提示，盡管S100A4沒有明確的RA特異性，但其與全身炎癥、RAFLSs活化相關(guān)，是預(yù)測患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸、疾病活動程度的有效指標?；赟100A4在RA發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，人們開展了相關(guān)干擾藥物的臨床試驗研究，包括抑制S100A4的表達和分泌、阻斷S100A4受體相互作用及通過S100A4誘導先天免疫耐受等等，為RA的治療提供了新的選擇，但目前尚處在臨床試驗階段。

總之，S100A4異常表達與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其介導RA的分子機制尚未完全明確，這就需要圍繞參與RA的關(guān)鍵細胞，進一步探討S100A4發(fā)揮作用的分子機制；而作為監(jiān)測RA疾病活動的生物標志物之一，未來仍需全面探索S100A4在RA中的作用，對其功能模式進行深入研究，以尋找運用先天性和適應(yīng)性免疫機制治療RA的新分子靶點。