超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法測定克氏螯蝦中39種獸藥殘留

宋 偉, 趙暮雨, 韓 芳, 呂亞寧, 丁 磊, 周典兵, 鄧曉軍, 胡艷云*, 鄭 平, 盛 旋

(1. 安徽出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 安徽 合肥 230022; 2. 食品安全分析與檢測安徽省重點(diǎn)實驗室,安徽 合肥 230022; 3. 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 上海 200135)

克氏原螯蝦又稱紅螯蝦、淡水小龍蝦,是市場上深受歡迎的水產(chǎn)食品,同時也是我國重要的出口產(chǎn)品,而藥物殘留是當(dāng)前影響克氏原螯蝦養(yǎng)殖質(zhì)量安全的關(guān)鍵危害因子[1,2],根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定,磺胺類藥物在克氏原螯蝦肌肉組織中的總量不得超過100 μg/kg,恩諾沙星與環(huán)丙沙星之和不得超過100 μg/kg,達(dá)氟沙星不得超過100 μg/kg,二氟沙星不得超過300 μg/kg,并禁止使用孔雀石綠。目前針對動物源性產(chǎn)品中藥物殘留的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[3,4]、液相色譜法[5-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]等,但這些方法所能檢測的目標(biāo)物數(shù)量及確證能力有限。其中酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果易受試劑質(zhì)量的影響,對結(jié)構(gòu)類似物有一定程度的交叉反應(yīng),容易出現(xiàn)假陽性;液相色譜法靈敏度較低,選擇性和特異性較差;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖然方法靈敏度和特異性都比較高,但由于難以完全闡明化合物的結(jié)構(gòu)裂解信息,定性準(zhǔn)確度方面尚有欠缺;另外受通道駐留時間限制,能同時檢測的化合物數(shù)量有限。而超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(UHPLC-Q-TOF/MS)作為一種結(jié)合了超高效液相色譜高分離能力和四極桿飛行時間質(zhì)譜高分辨功能的聯(lián)用技術(shù),不僅可以提供母離子的精確相對分子質(zhì)量,還可以提供大量二級碎片離子及其精確分子質(zhì)量信息,預(yù)測元素組成并輔助結(jié)構(gòu)鑒定,大大提高了復(fù)雜背景下的抗干擾能力,使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確,具有選擇性高、受基質(zhì)干擾小、方法建立過程簡單等優(yōu)點(diǎn)[12-15],理論上可以分析的化合物沒有數(shù)量限制,能為水產(chǎn)品中大量藥物及污染物篩查分析提供更具優(yōu)勢的篩查技術(shù)手段。

樣品前處理技術(shù)是獸藥殘留分析的關(guān)鍵步驟,直接影響檢測結(jié)果。QuEChERS作為一種簡單、快速、高效的藥物多殘留的前處理方法,近些年已被引入獸藥殘留分析[16-18],其常規(guī)凈化吸附劑主要包括C18、N-丙基乙二胺粉末(PSA)、石墨化炭黑等。隨著技術(shù)的快速發(fā)展,目前一些新型材料也被應(yīng)用于QuEChERS方法,以有效去除樣品中的脂肪、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)。如EMR-Lipid作為QuEChERS增強(qiáng)型脂質(zhì)去除產(chǎn)品,已有研究表明其能高效并選擇性地去除高脂肪食品中的脂質(zhì)[18-20]。另外,隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展,石墨烯[21]、多壁碳納米管[22,23]等一些新型納米吸附劑填料也在QuEChERS技術(shù)中得到了應(yīng)用研究。將新型高效凈化吸附劑結(jié)合QuEChERS法應(yīng)用于水產(chǎn)品中獸藥的殘留分析,將有效提高樣品前處理速度及凈化效果。

本文采用增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化劑(EMR-Lipid,簡稱EMR)結(jié)合石墨化多壁碳納米管作為QuEChERS法吸附劑對克氏螯蝦樣品進(jìn)行前處理,同時采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)建立喹諾酮類、磺胺類、三苯甲烷類39種藥物殘留一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫及二級碎片譜圖庫。通過比對準(zhǔn)分子離子的精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比、保留時間等信息對目標(biāo)物進(jìn)行初篩,之后通過二級譜圖譜庫檢索比對進(jìn)行確證,最終以一級提取離子色譜圖峰面積進(jìn)行定量,建立適合于克氏螯蝦中39種獸藥殘留檢測的快速篩查方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290-6540超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(Agilent,美國); Avanti J-E高速冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter,美國); N-EVAP112氮吹濃縮儀(OA-SYS,美國); PL602-L電子天平(Mettler,德國); T25均質(zhì)器(IKA,德國); Vortex-Genie 2渦旋混勻器(Scientific Industries,美國); Milli-Q超純水機(jī)(Merck Millipore,美國)。

標(biāo)準(zhǔn)品:磺胺醋酰(sulphacetamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺噻唑(sulfathiazole)、磺胺吡啶(sulfapyridine)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)、三甲氧芐氨嘧啶(trimethoprim)、磺胺二甲嘧啶(sulfadimidine)、磺胺甲氧噠嗪(sulfamethoxypyridazine)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)、磺胺對甲氧嘧啶(sulfameter)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)、磺胺氯噠嗪(sulfachloropyridazine)、磺胺甲基異惡唑(sulfamethoxazole)、磺胺二甲異惡唑(sulfisoxazole)、磺胺苯酰(sulfabenzide)、磺胺間二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine)、磺胺喹惡啉(sulfachinoxalin)、磺胺苯吡唑(sulfaphenazole)、磺胺硝苯(sulfanitran)、麻保沙星(marbofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、氟羅沙星(fleroxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、丹諾沙星(danofloxacin)、恩諾沙星(enrofloxacin)、奧比沙星(orbifloxacin)、沙拉沙星(sarafloxacin)、雙氟沙星(difloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、氟甲喹(flumequine)、惡喹酸(oxolinic acid)、萘啶酸(nalidixic acid)、孔雀石綠(malachite green)、隱色孔雀石綠(leucomalachitegreen)、結(jié)晶紫(crystal violet)、隱色結(jié)晶紫(leucocrystalviolet)(純度≥99%,德國Dr. Ehrenstorfer公司);甲酸、乙酸、乙腈(色譜純,美國Tedia公司);氯化鈉、無水硫酸鎂、乙酸銨(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); PSA、C18吸附劑(美國Waters公司);EMR-Lipid(美國Agilent公司);石墨化多壁碳納米管(直徑>50 nm,長度:10～20 μm,純度>99.9%,南京先豐納米材料科技有限公司)。

獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取上述39種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg(精確至0.1 mg),分別置于10 mL棕色容量瓶中,用乙腈溶解并定容,標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度均為1 mg/mL,于-18 ℃避光保存。實驗中根據(jù)每種目標(biāo)化合物的定量限,用空白樣品提取液逐級稀釋配制成不同濃度的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 樣品前處理

將克氏螯蝦樣品去頭、去殼,取可食部分用勻漿機(jī)制樣,于-18 ℃冷凍貯存?zhèn)溆?。稱取4 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中,加入10 mL 1%(v/v)甲酸乙腈溶液,13 500 r/min均質(zhì)提取1 min,于-4 ℃、10 000 r/min冷凍離心20 min。取5 mL上清液至預(yù)先用5 mL水浸潤活化過的EMR-Lipid管中,渦旋振蕩2 min,之后于4 ℃條件下10 000 r/min離心5 min。取上清液5 mL移入加有0.5 g氯化鈉、2.0 g無水硫酸鎂的反萃管中,渦旋振蕩1 min后,于4 ℃條件下10 000 r/min離心5 min,再將上層乙腈層轉(zhuǎn)移至加有30 mg石墨化多壁碳納米管的凈化管中,渦旋振蕩2 min,于4 ℃條件下10 000 r/min離心5 min。最后取上層清液至10 mL玻璃管中,在45 ℃用氮?dú)鉂饪s儀吹干,準(zhǔn)確加入500 μL初始流動相溶解殘渣,過0.2 μm濾膜,待上機(jī)檢測。

1.3 UHPLC-Q-TOF/MS條件

1.3.1色譜條件

色譜柱:安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);流動相:A相為5 mmol/L乙酸銨-0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為乙腈。梯度洗脫程序:0～1 min, 5%B; 1～6min, 5%B～15%B; 6～20 min, 15%B～30%B; 20～22 min, 30%B～90%B;然后保持3 min;之后由90%B降到5%B,保持5 min。流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;干燥氣溫度:325 ℃;干燥氣流速:10 L/min;霧化器壓力:276 kPa;鞘流氣溫度:300 ℃;鞘流氣流速:11 L/min;毛細(xì)管電壓(capillary voltage): 4 000 V;掃描方式:正離子掃描,target MS/MS模式;TOF一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍(m/z): 50～1 000;碎裂電壓(FP): 100 V。

UHPLC-Q-TOF/MS配置了雙噴霧器電噴霧源,可以連續(xù)導(dǎo)入?yún)⒈热芤簩x器質(zhì)量軸進(jìn)行實時校正。選取m/z121.050 8和m/z922.009 7作為參比離子,對測定的目標(biāo)物實時進(jìn)行質(zhì)量數(shù)校正,確保質(zhì)量數(shù)誤差小于5×10-6(5 ppm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件中的碎裂電壓和碰撞能量是影響離子豐度的重要條件,與方法的靈敏度密切相關(guān)。首先通過化合物結(jié)構(gòu)式建立39種獸藥的一級精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫,之后在ESI+模式下對單個分析物的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行全掃描,確定各化合物的母離子并優(yōu)化碎裂電壓(FP)。FP過低時不利于離子聚焦和傳輸,FP過高時會造成離子的源內(nèi)裂解,兩種情況都會對母離子響應(yīng)造成影響。由于在TOF/MS掃描時質(zhì)譜FP參數(shù)只能設(shè)置一個通用值,為兼顧各種化合物的響應(yīng)以獲得較高靈敏度,FP電壓設(shè)為100 V。

以不同藥物一級質(zhì)譜獲得精確質(zhì)量數(shù)的分子離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,得到不同碰撞能量下各化合物的二級質(zhì)譜圖,然后通過儀器自帶譜庫編輯軟件,建立39種獸藥信息及二級譜圖庫。根據(jù)各化合物不同碰撞能下的二級譜圖對比,選出合適的碰撞能量作為該藥物篩查方法的二級碰撞能(見表1)。

表 1 39種獸藥化合物的分子式、保留時間及碰撞能

2.2 色譜條件優(yōu)化

流動相是影響化合物離子化的重要條件,影響色譜峰形和分離效果。實驗比較了乙腈-水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨-0.1%(v/v)甲酸水溶液3種流動相條件下色譜峰的分離及響應(yīng)情況,發(fā)現(xiàn)在ESI+模式下,流動相中加入一定比例的甲酸有利于提高目標(biāo)物的離子化效率,增大化合物的響應(yīng)值。但孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫4種物質(zhì)的色譜峰峰形及響應(yīng)較差。而在流動相中再加入少量乙酸銨時,以上4種物質(zhì)的出峰情況得到明顯改善。為了盡量減少干擾、提高化合物響應(yīng)并實現(xiàn)同分異構(gòu)體的分離,實驗最終采用乙腈-5 mmol/L乙酸銨-0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動相,以1.3.1節(jié)的梯度洗脫條件實現(xiàn)了39種化合物的分離檢測,特別是對同分異構(gòu)體磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶實現(xiàn)了有效分離測定(見圖1), 39種化合物的保留時間見表1。

2.3 確定篩查檢索標(biāo)準(zhǔn)

為保證篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性,實驗基于化合物的保留時間、一級母離子精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比及二級質(zhì)譜特征碎片譜圖作為指標(biāo)建立檢索標(biāo)準(zhǔn)。采用target MS/MS掃描模式,一針進(jìn)樣同時獲取一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。經(jīng)優(yōu)化,當(dāng)一級篩查以±20×10-6(20 ppm)精確質(zhì)量偏差提取化合物的分子離子峰,保留時間限定范圍在±0.5 min,離子化形式選擇+H、+NH4、+Na模式時,檢索結(jié)果得分值≥70的化合物可初步確定為疑似陽性。之后對二級譜圖進(jìn)行檢索確證,檢索得分≥60的化合物被確證為目標(biāo)藥物。檢索得分<60的化合物可通過背景扣除來降低雜質(zhì)離子對檢索的影響;如果仍不能達(dá)到得分要求,則需對比其主要碎片離子,若有兩個及兩個以上的主要碎片離子匹配,則可確證為目標(biāo)藥物。對加標(biāo)樣本進(jìn)行測定,化合物鎖定的保留時間誤差范圍均小于0.2 min,經(jīng)參比溶液實時校準(zhǔn),所有化合物的質(zhì)量數(shù)誤差絕對值均小于5.0 ppm,滿足歐盟的定性要求,方法實現(xiàn)了39種藥物的無標(biāo)準(zhǔn)品、高選擇性的快速篩查和確認(rèn)。以三甲氧芐胺嘧啶為例進(jìn)行說明,如圖2所示,化合物經(jīng)保留時間、一級母離子精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比比對,與三甲氧芐胺嘧啶的匹配得分為97.5,之后進(jìn)入二級質(zhì)譜圖檢索比對,與譜圖庫中三甲氧芐胺嘧啶二級質(zhì)譜圖的相似度得分為95.4,確證為三甲氧芐胺嘧啶。

圖 1 39種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)液的總離子流色譜圖

圖 2 三甲氧芐胺嘧啶的提取離子色譜圖(EIC)、一級質(zhì)譜圖及二級碎片離子檢索對比圖

2.4 提取方法的優(yōu)化

實驗比較了乙腈、1%(v/v)甲酸乙腈、乙酸乙酯、甲醇作為提取溶劑時的提取效果。其中以乙酸乙酯、甲醇提取時,提取液渾濁,提取效率低;以乙腈作為提取試劑時,雖能夠更有效地沉淀蛋白質(zhì),減少雜質(zhì)干擾,但部分化合物提取回收率較低;而采用1%(v/v)甲酸乙腈提取時,39種獸藥均取得了較好的提取效果,回收率均高于60%。因此實驗最終采用1%(v/v)甲酸乙腈作為提取溶劑。為減少樣品中脂類物質(zhì)的干擾,實驗在樣品提取后采用冷凍離心法,將乙腈提取液于-4 ℃10 000 r/min冷凍離心20 min,吸取5 mL上清液進(jìn)行下一步實驗。

圖 3 不同凈化方式下獸藥回收率分布圖

圖 4 不同凈化方式下獸藥基質(zhì)效應(yīng)分布圖

2.5 凈化條件的優(yōu)化

本文分別考察了C18、PSA、EMR 3種吸附凈化劑的效果。C18可吸附樣品中的脂肪和蛋白質(zhì),PSA可吸附樣品中的脂肪酸和糖類雜質(zhì),但實驗發(fā)現(xiàn)在20 μg/kg添加水平下,C18、PSA的凈化效果不理想,對部分藥物均有不同程度的吸附,分別有7種和14種目標(biāo)物的回收率低于70%(見圖3)。EMR具有疏水選擇性和吸附作用,對含有直鏈烴結(jié)構(gòu)的脂類等大分子物質(zhì)去除率較高,當(dāng)采用EMR處理時,僅有3種藥物的回收率低于70%,質(zhì)譜圖中的雜質(zhì)峰相對其他兩種吸附劑明顯減少。按照基質(zhì)效應(yīng)(ME)=(1-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%計算目標(biāo)獸藥的基質(zhì)效應(yīng),3種方式凈化后的基質(zhì)效應(yīng)分布見圖4。結(jié)果表明,采用EMR吸附凈化手段,基質(zhì)效應(yīng)明顯降低,最終選取EMR作為凈化分散劑。實驗通過比較不同用量(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g)分散劑的吸附凈化效果,發(fā)現(xiàn)隨著EMR的使用量從0.4 g增加到1.0 g, 39種獸藥的平均回收率由72.6%上升到82.3%,平均基質(zhì)效應(yīng)(基質(zhì)效應(yīng)取絕對值后平均)由35.9%降低到25.7%,但增加到1.2 g時平均回收率為80.6%,略有降低。實驗最終選取凈化分散劑EMR的量為1.0 g。

NaCl可使樣品中的水分充分析出,從而有利于吸水劑的吸附。無水MgSO4吸水容量大,能明顯減少水相,從而促進(jìn)獸藥在有機(jī)相中的分配和兩相的分層,在提取步驟中,MgSO4水合作用是一個強(qiáng)放熱過程,可使提取液變熱,有利于提高提取效率[24]。實驗選取NaCl和無水MgSO4分別作為鹽析劑和脫水劑。另外為減少色素等其他基質(zhì)的干擾,實驗分別對加入5、10、20、30、40、50 mg石墨化多壁碳納米管的凈化效果進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)當(dāng)石墨化多壁碳納米管用量從5 mg增至30 mg時,凈化后的溶液能夠更澄清、干凈,雜質(zhì)干擾峰減少。但當(dāng)石墨化多壁碳納米管用量增至40 mg時,大部分獸藥的提取回收率開始出現(xiàn)下降,說明吸附劑過多會導(dǎo)致目標(biāo)物的吸附、損失(見圖5)。實驗最終選擇加入30 mg石墨化多壁碳納米管為凈化吸附劑。

圖 5 不同用量石墨化多壁碳納米管下39種獸藥的平均回收率

2.6 方法的線性關(guān)系、定量限、回收率和精密度

根據(jù)目標(biāo)化合物在質(zhì)譜中的響應(yīng),以空白樣品提取液配制不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列,在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定,以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以相應(yīng)組分的響應(yīng)值為縱坐標(biāo),結(jié)果顯示39種獸藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)(r2)均在0.99以上。以不同添加水平下空白基質(zhì)的儀器響應(yīng)為基準(zhǔn),分別以3倍信噪比和10倍信噪比考察了方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ), 39種獸藥的LOQ為3～15 μg/kg(見表2)。

表 2 39種獸藥的線性回歸方程、r2、線性范圍、檢出限及定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

表 3 39種獸藥的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

圖 6 陽性樣品的EIC圖

為了評估方法的準(zhǔn)確性,在LOQ、2LOQ及4LOQ 3個添加水平下進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗,每個水平做6個平行樣品,39種獸藥的回收率及RSD見表3,結(jié)果表明方法能夠滿足實際檢測的要求。

2.7 實際樣本檢測

在最佳實驗條件下對20個克氏螯蝦樣品中的獸藥殘留進(jìn)行篩查,其中1份克氏螯蝦樣品檢出禁用藥物孔雀石綠,一級篩查得分90.3,二級確證得分75.4,含量為4.63 μg/kg; 1份克氏螯蝦檢出恩諾沙星,一級篩查得分96.5,二級確證得分92.1,含量為15.82 μg/kg,未超出我國限量標(biāo)準(zhǔn)(見圖6);剩余樣品均未檢出這39種獸藥殘留。為了驗證檢測結(jié)果,實驗室參照國家標(biāo)準(zhǔn)[25,26],采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法對上述檢出的陽性樣品進(jìn)行了對比測試,分別測得孔雀石綠含量平均值為5.01 μg/kg，恩諾沙星含量平均值為16.26 μg/kg，經(jīng)t檢驗法分析，p值均大于0.05，兩種方法所測結(jié)果無顯著性差異。

3 結(jié)論

本工作建立了克氏螯蝦中喹諾酮類、磺胺類、三苯甲烷類共39種獸藥的快速篩查方法。樣品經(jīng)酸化乙腈提取,EMR-Lipid結(jié)合石墨化多壁碳納米管凈化,UHPLC-Q-TOF-MS一針進(jìn)樣,同時進(jìn)行一級初篩及二級確證,方法簡便、快速、準(zhǔn)確,可有效避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn),為克氏螯蝦中39種獸藥殘留的快速篩查和確證提供了技術(shù)支持,同時也可以為其他水產(chǎn)品中多獸藥殘留的篩查提供方法參考。