血小板自噬在深靜脈血栓形成中的研究進展

周霞慶 王靈聰

作者單位：310053 浙江中醫(yī)藥大學（周霞慶）310006 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院（王靈聰）*通信作者

深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是血液在深靜脈腔內異常凝結，阻塞靜脈管腔，導致靜脈回流障礙，引起遠端靜脈高壓、肢體腫脹、疼痛及淺靜脈擴張等臨床癥狀，多見于下肢，可造成不同程度的慢性深靜脈功能不全，如不能有效的預防，可形成肺栓塞、血栓形成后綜合征等嚴重并發(fā)癥，危及患者的生命。近年來隨著對DVT 的關注，其患病率和確診率在周圍血管疾病中高達40%［1］。因此國內外指南均推薦使用機械方法和藥物抗凝預防DVT，但是采用藥物抗凝預防，易發(fā)生出血，嚴重可致顱內出血。因此，DVT 的預防已越來越成為關注的話題，尋找能降低DVT 發(fā)生率且不易導致出血的藥物已成為目前臨床需要解決的問題。自噬是一種高度保守的生物學現(xiàn)象細胞內的膜性小泡，并隨后吞噬和輸送各種細胞成分（蛋白質、細胞器和入侵的病原體）到溶酶體進行降解和物質循環(huán)的過程，通過適當降解長壽蛋白、蛋白聚集物或受損的細胞器，最終確保細胞內的穩(wěn)態(tài)［2］。通常來說，自噬是真核細胞中一個保守的分解代謝過程，同時也是真核細胞中高度保守的生物學過程，其參與細胞發(fā)育、饑餓適應、腫瘤抑制、衰老、先天免疫等過程［3］，而研究共同證明，健康人類的無核血小板中也存在自噬［4］，且血小板自噬的基礎水平對血小板聚集、止血和血栓形成至關重要。甚至血小板自噬的不足或是過度都有可能導致機體病理改變［5］。近年來，有報道稱血小板自噬通過影響血小板粘附、聚集功能，進而影響動脈血栓形成［6］，而相對于血小板自噬對動脈血栓形成的作用，其對深靜脈血栓形成的報道較少，但是已經有研究證明正常血小板自噬過程的擾動與深靜脈血栓形成有關，因此本文將就血小板自噬和深靜脈血栓形成做一綜述。

1 深靜脈血栓形成的發(fā)病機制

雖然目前DVT 的具體發(fā)病機制還有待于進一步研究，但是血栓形成的三要素為血管壁改變、血液性質的改變以及血流的變化，因此任何可以導致靜脈血液淤滯、靜脈系統(tǒng)內皮損傷和血液高凝狀態(tài)的因素均是DVT 的危險因素。無論是血液高凝狀態(tài)還是血液瘀滯因素，血小板在血栓形成過程中發(fā)揮著重大的作用。其中血小板在動脈血栓中扮演重要角色，通過起始、擴增、穩(wěn)定三個階段最終形成穩(wěn)定的動脈血栓。雖然在深靜脈血栓形成中占主要的不是血小板，但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)血小板在深靜脈血栓形成過程中也起到重要作用［7-9］。例如雷帕霉素復合物1（mTORC1）通過升高血小板大小和激活有助于增強小鼠的靜脈血栓形成易感性［10］。

2 血小板與DVT

在血栓形成的經典觀點中，血小板被認為在動脈血栓形成中起著關鍵作用，而血小板不被認為在靜脈血栓形成中起著主要作用。但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，血小板不論通過其數(shù)量還是功能，其在深靜脈血栓中發(fā)揮著關鍵作用［11-13］。Quarmby 等［14］對30 例雙側靜脈曲張患者進行了大隱靜脈血栓形成的實驗研究，并利用光鏡和掃描電鏡研究了這些實驗血栓的組成，發(fā)現(xiàn)血栓主要由紅細胞和纖維蛋白血小板層組成，活化的血小板和白細胞隨機分布在血栓的整個結構中，從其結構形成中再次驗證了血小板在DVT 中的作用。

3 血小板自噬和DVT

3.1 血小板自噬概述 血小板是由巨核細胞分化而來的小的無核細胞質碎片，主要的生理作用是介導血栓形成和止血，盡管自噬在無核細胞中很少被發(fā)現(xiàn)，但Lewis、Maldonado、Mann 和Moertel 首次在血小板中檢測到自噬。饑餓、雷帕霉素可誘導血小板自噬，研究進一步證明了從全體雜合Becn1敲除小鼠分離的血小板中存在缺陷的血小板聚集和粘附［15］，表明自噬在血小板中是存在的，如果沒有自噬，血小板的聚集和粘附能力可能會停止。因此血小板自噬對血小板數(shù)量和功能有顯著影響。然而，在某些病理條件下自噬下調可能導致血栓形成。大鼠深靜脈血栓形成模型的體內研究表明，雷帕霉素治療后血栓形成增加［16］。

3.2 血小板自噬和深靜脈血栓形成 眾所周知，血小板的過度活化會導致血栓形成，自噬在血栓形成中調節(jié)血小板的活化。自噬激動劑雷帕霉素通過促進血小板與內皮細胞粘附從而導致深靜脈血栓形成［16］。此外，血小板內皮細胞的粘附是通過誘導自噬進行細胞膜重構所必需的。Fecl-3 誘導小鼠頸動脈損傷模型表現(xiàn)出較強的出血特性，阻斷時間較長，表明血小板自噬的缺失導致止血和血栓形成。更重要的是，Wang 等［17］發(fā)現(xiàn)ox-LDL 誘導的氧化應激引發(fā)血小板活化并增加ROS 產生，從而抑制PI3K/AKT/mTOR 信號傳導途徑的下游活性，促進血小板自噬，并加劇血小板聚集和粘附。因此血小板自噬在深靜脈血栓形成過程中發(fā)揮重大的作用。

最近，許多研究描述了血小板自噬過程及其機制的基礎水平［18-19］，自噬是真核生物的一種進化保守的降解過程，對細胞的穩(wěn)態(tài)具有重要作用，其包括將蛋白質聚集物和受損的細胞器隔離到自噬體的雙膜囊泡中，自噬體與多泡體、晚期核內體和溶酶體融合以進行降解。自噬包括幾個順序步驟：誘導、識別、自噬體形成、自噬體-溶酶體融合、降解產物的回收，所有這些步驟都由不同的自噬相關蛋白（ATG）協(xié)調。研究報道，與某些有核自噬相似，血小板自噬也表達許多蛋白和基因，這些包括ULK1、FIP200、Beclin 1、VPS34、VPS15、ATG14、NRBF2、UVRAG、ATG7、ATG3、ATG8（LC3）、ATG12、SQSTM1/p62 和PIK3C3 等［19-20］。目前研究可知，ATG7、ATG5 和Beclin1 在血小板自噬中發(fā)揮著作用。研究表明，小鼠Beclin1 等位基因缺失可延長出血時間，降低血小板聚集，提示血小板可能需要Becn1 依賴的自噬［12］。此外，通過敲除ATG7 導致干細胞階段自噬的缺失，表現(xiàn)出巨核生成受損、血栓生成和止血，產生更多但更少的功能失調血小板［11］。然而，使用pf4-cre 的方法在成熟巨核細胞和血小板中缺失ATG7 只會導致異常止血，而血小板數(shù)量和大小保持不變。這些研究均表明自噬是正常血小板所必須的，血小板自噬在血栓形成的過程中起到重要的作用，且自噬蛋白ATG7 缺失可造成血栓的形成。在ATG7 缺失小鼠中，血小板在聚集和顆粒狀貨物包裝中部分失活，結果表明ATG7可能是血小板自噬在止血和血栓形成過程中發(fā)揮作用的限速因子。ATG5 是自噬機制的核心蛋白，參與典型的自噬和非典型的與內吞有關的形式，而ATG5 在自噬中發(fā)揮作用主要是通過在極化的B 細胞中參與BCR 的轉運和溶酶體和MIIC的募集［21］。一般自噬發(fā)生在血小板中，以ATG5 依賴的方式響應饑餓［22］。有研究顯示在小鼠中ATG5 中度過表達會使自噬活性增加［23］，加快DVT 的溶解，則之相反。自噬的信號調控非常復雜，目前尚未完全明確，現(xiàn)在比較明確的有3 種途徑，分別是mTOR 途徑、Bcl-2 途徑和class III PIK/PKB 途徑。研究報道稱，血小板自噬是由III 類PtdIns3K（III 類磷脂酰肌醇3 激酶）活性和MTOR 抑制引起的信號介導的。此外III 型PI3K 和PtdIns3P 與復合物中的Becn 1 共同在控制自噬通路中發(fā)揮重要作用。在人血小板中通過刺激劑發(fā)現(xiàn)了PtdIns3P 隨著時間依賴，其在不同時間點呈現(xiàn)峰值變化，且3-甲基腺嘌呤抑制PtdIns3P 的形成，同時PtdIns3P 是III 型P13K 以PtdIns 為底物產生的［24］。然而，III 類PI3K 在活化的血小板中并沒有被證明是一種自噬調節(jié)因子［25］。具體機制還有待于進一步研究。但是研究證明自噬降低血小板數(shù)量，縮短血小板壽命［26］。與上述結果相似，通過抑制自噬可以抑制巨核生成和巨核生成早期的血栓形成［27］。此外，自噬水平的升高或降低嚴重干擾了巨核生成的進程［28］。結果表明，自噬的基礎水平在巨核細胞的產生中起著重要作用，而自噬對血栓的形成具有重要作用。

在生理條件下，自噬水平非常低，但在應激反應時，如缺氧時，自噬水平上調。在饑餓條件下，血小板的自噬水平增加。相反，血小板自噬的作用是相反的。饑餓會降低自噬升高引起的血小板聚集。在饑餓狀態(tài)下，血小板表現(xiàn)為鈣動員減少，顆粒分泌和與固定的纖維蛋白粘附減少，此外，饑餓期間增加的自噬可以進一步減少血小板聚集。饑餓模型大鼠血小板聚集減少，尾出血時間延長［29］?？傊珹TG5 和ATG7 自噬蛋白的過度表達及Beclin 1 基因的缺失使血小板自噬上調，從而減少止血和血栓形成，促進血小板活化，有利于血栓的機化和溶解，相反，ATG5 和ATG7 缺失使自噬活性降低，通過血小板自噬下調而抑制血小板活化，加快深靜脈血栓的形成。

4 結語

綜上所述，血小板在深靜脈血栓形成中起著關鍵作用，且血小板中存在自噬，血小板自噬可通過自噬蛋白ATG7、ATG5 和Beclin1 信號通道對DVT 進行調節(jié)，上調血小板自噬促進DVT 溶解，下調血小板自噬則促進血栓形成，但是具體機制仍有待于進一步完善。血小板自噬對DVT 的雙向調節(jié)作用的基礎理論可為臨床上DVT 預防方面提供新方向。