纖維環(huán)退變機制及生物學治療的研究綜述*

金新蒙楊鐵毅王雷

（1.第二軍醫(yī)大學附屬公利醫(yī)院骨科，上海200135；2.上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院骨科，上海200080）

隨著全球老齡化、生活方式及職業(yè)壓力的變化，腰背痛的發(fā)病率越來越高。據(jù)估計，80%的人們在一生中會遭受各種形式的腰背痛，嚴重影響人類的健康[1]。盡管腰背痛的病因多種多樣，但椎間盤退變已然成為慢性腰背痛的主要原因。目前椎間盤退變的基本機制尚未闡明，其退變的病理因素之一為纖維環(huán)的應力損傷，致使纖維環(huán)破裂、髓核突出[2]。在預防和治療椎間盤退變中，纖維環(huán)的生物學作用越來越受到重視，修復和維持纖維環(huán)的完整性有著重要的意義。隨著現(xiàn)代分子生物學、細胞工程學、基因工程技術的發(fā)展，退變纖維環(huán)生物治療的方法已經(jīng)得到初步發(fā)展，本文就目前纖維環(huán)退變機制及生物學治療進行綜述。

1 纖維環(huán)退變的生物學機制

1.1 解剖特點

纖維環(huán)位于椎間盤的周緣部，由內、外層呈同心圓排列的纖維構成，內層是纖維軟骨帶，外層主要為膠原纖維。纖維環(huán)中心部位的纖維插入到終板軟骨內，而外周部位的纖維錨定在椎骨上。內層纖維環(huán)占總徑向厚度的50%，該層細胞呈圓形，至少有兩個突起，突起無一定的方向性，主要是軟骨細胞；外層纖維環(huán)內的細胞細長呈梭形，沿著膠原纖維的長軸分布，主要是纖維細胞[3]。內外層纖維環(huán)的化學組成成分也不同。內層纖維環(huán)包括Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白，聚蛋白多糖存在于內外層纖維環(huán)內，而多聚糖和二聚糖主要存在于外層纖維環(huán)內。健康人類纖維環(huán)的含水量為50%，膠原蛋白占干重的70%，蛋白多糖占干重的10%，彈力蛋白占干重的2%[3]。從外層纖維環(huán)到內層纖維環(huán)，Ⅰ型膠原蛋白與Ⅱ型膠原蛋白的比例減少，蛋白多糖的含量增高。這一改變導致外層纖維環(huán)承受更多的拉力，髓核承受更多的壓縮力[4]。膠原纖維的走行趨向于應力的方向，層內纖維平行排列，具有高度趨向性，層間纖維具有相反的斜度而相互交叉。在應力作用下外層纖維環(huán)可以發(fā)生再定向，從而改變其生物力學，提高其抗牽拉、抗壓及抗扭轉強度，降低纖維環(huán)的膨出率[5]。

1.2 退變機制

近年來，研究發(fā)現(xiàn)纖維環(huán)退變的發(fā)病機制與許多因素有關，如衰老、生物力學、營養(yǎng)障礙、遺傳、免疫等。這些因素觸發(fā)纖維環(huán)形態(tài)學特征發(fā)生改變，細胞功能異常、數(shù)量減少，細胞外基質合成下降、降解增多[6]。已有研究在退變椎間盤內發(fā)現(xiàn)細胞衰老的分子標志物，且細胞衰老加速與椎間盤退變相關。隨著年齡的增長，纖維環(huán)細胞數(shù)量的減少、胞間距離變大使縫隙連接減少，從而導致細胞間的信號交流發(fā)生障礙，維持、修復纖維環(huán)結構和功能的能力顯著下降[7]。此外，層間纖維蛋白排列紊亂且纖維連接增多，限制了膠原纖維的再定向分布，增加了纖維層間的剪切力，使纖維環(huán)抗負荷力及應力分散力明顯降低，進而降低了纖維環(huán)的穩(wěn)定性，導致纖維環(huán)膨出[5]。

細胞外基質合成與降解失衡被認為是椎間盤退變的基礎。在椎間盤退變過程中，細胞外基質的合成和分布發(fā)生改變。髓核細胞和內層纖維環(huán)細胞合成Ⅱ型膠原蛋白減少，而Ⅰ型膠原蛋白增加。此外，蛋白聚糖的含量降低，導致椎間盤內含水量減少，使組織更加纖維化，抗負荷能力降低[4]。相反，一些蛋白水解酶，如基質金屬蛋白酶（MMPs-1、-3、-7、-9、-10和-13）和Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS-1、-4、-5、-9和-15）表達增加，炎癥調節(jié)因子如腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素-1（IL-1）可以上調ADAMT-4和ADAMTS-5的表達水平，同時促進聚蛋白聚糖的降解[8]。金屬蛋白酶內源性抑制劑（TIMPs）和ADAMTS之間相互作用的失衡，進一步導致了退變椎間盤的基質降解。

細胞凋亡被認為是椎間盤細胞死亡的主要機制，非生理性的負荷、營養(yǎng)障礙、細胞外基質變化等因素均可能誘導細胞凋亡。但是，由于細胞凋亡和細胞外基質降解增多之間并未發(fā)現(xiàn)明顯的因果關系，因此，程序化細胞死亡可能在椎間盤疾病中扮演著重要的角色。細胞自噬是另一條引起細胞程序性死亡的途徑，其在大鼠髓核和纖維環(huán)中均被發(fā)現(xiàn)。營養(yǎng)的缺乏和應力也會誘導椎間盤細胞的自噬，通過對關鍵標記物LC-3和beclin-1的免疫染色，證明在人類退變椎間盤組織內同樣存在著自噬現(xiàn)象[6]。TGF-β1通過下調過度自噬來預防纖維環(huán)細胞的凋亡，該過程可能涉及PI3K-AKT-mTOR和MAPKERK1/2信號傳導途徑[9]。雖然細胞自噬可以導致細胞死亡，但也可以通過對細胞內細胞器、未折疊或受損蛋白的降解來維持細胞在長期環(huán)境或營養(yǎng)壓力負荷下的活力。因此，關于細胞自噬在纖維環(huán)退變中的作用還需要更多的研究證實。

機械負荷對于椎間盤細胞基質的穩(wěn)態(tài)非常重要，正常的髓核和纖維環(huán)之間分擔的生理負荷（髓核主要為壓力負荷，纖維環(huán)主要為牽張力負荷）可維持椎間盤的穩(wěn)態(tài)。適度的、低頻率的載荷作用于椎間盤細胞均可促進合成代謝，而大重量、高頻率和持續(xù)靜態(tài)載荷則誘導分解代謝或拮抗合成代謝[3]。Court等[10]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠模型通過使椎間盤側屈來減小凸側纖維環(huán)的張力和壓力，僅壓力側（凹側）會刺激細胞凋亡，分解代謝相關基因的表達增加，合成代謝相關基因表達下降。Kobielarz等[11]通過定性和定量對比正常人和特發(fā)性脊柱側凸患者胸腰椎纖維環(huán)細胞外基質的蛋白質含量，發(fā)現(xiàn)特發(fā)性脊柱側凸患者纖維環(huán)內膠原蛋白和彈性蛋白的結構顯著異常，而且Ⅰ型膠原蛋白和彈性蛋白的含量顯著降低。說明異常應力加速纖維環(huán)退變的過程，但具體機制還需要進一步闡明。綜上，上述因素之間并非相互獨立，而是相互關聯(lián)的。

2 纖維環(huán)退變的分子治療

目前，主要根據(jù)纖維環(huán)退變的程度來決定治療策略，主要考慮的因素有椎間盤的結構、椎間盤細胞的活力、細胞外基質等。手術治療無法改變退變纖維環(huán)中異常的胞外基質環(huán)境以及功能性細胞和組織的損失。分子治療旨在抑制異常的細胞因子產(chǎn)生，或刺激基質合成代謝。在椎間盤退變的早期階段，生長因子和蛋白酶抑制劑等分子治療手段比較理想。大量研究已表明，包括 TGF-β1、BMP-2、BMP-7、PDGF、FGF、EGF、IGF-1、OP-1、GDF5和GDF6等在內的許多生長因子能增強纖維環(huán)細胞增殖和促進細胞外基質分泌合成[12]。富血小板血漿（Platelet-rich plasma,PRP）中含有豐富的生長因子，可誘導纖維環(huán)細胞增殖和細胞外基質產(chǎn)生。將PRP注射到兔和大鼠椎間盤退變模型，發(fā)現(xiàn)髓核和內層纖維環(huán)中Ⅱ型膠原表達增加，并且可以修復早期椎間盤退變[13]。目前，臨床上使用PRP治療盤源性腰痛已有初步的研究。一項前瞻性雙盲隨機對照研究對29例盤源性腰痛患者的椎間盤內注射PRP，通過至少1年的隨訪結果發(fā)現(xiàn)，治療組在疼痛和功能改善上明顯優(yōu)于對照組，而且椎間盤內注射PRP是安全的[14]。雖然這些初步研究結果令人鼓舞，但仍需要進一步研究來確定最佳的治療對象，以及PRP的濃度和成分，反復多次注射是否仍然有效。在退變中期及晚期，椎間盤內細胞功能降低、低氧、營養(yǎng)缺乏及凋亡等因素都會使療效下降。目前，基于基因工程的治療尚缺乏能夠精確控制基因表達的理想調控系統(tǒng)，尚需進一步深入的研究。上述情況下，基于細胞的組織工程或再生療法被認為是治療中晚期退變椎間盤的潛在有效方法，當前已成為本領域研究的重點。

3 纖維環(huán)退變的細胞治療

細胞療法旨在通過組織工程學方式將具有生物活性的細胞植入椎間盤來幫助嚴重退變的椎間盤恢復正常生理功能。由于臨床上難以獲取健康、足夠數(shù)量的纖維環(huán)細胞，因此具有分化潛能的干細胞是目前細胞治療的首選，越來越多的研究證實其適用性。

3.1 纖維環(huán)祖細胞

近年來，有學者在正常及輕度退變椎間盤的纖維環(huán)中發(fā)現(xiàn)了具有多向分化特性的細胞，提示纖維環(huán)組織內可能存在祖細胞。這些祖細胞通常出現(xiàn)在邊緣或已遷移進入纖維環(huán)，它們對于正常結構和功能的維持至關重要，其數(shù)量減少或功能改變均可導致纖維環(huán)功能紊亂。退變纖維環(huán)內形成的軟骨、骨和神經(jīng)組織可能就是纖維環(huán)祖細胞分化的結果[15]。由于其來源于纖維環(huán)，纖維環(huán)祖細胞更易向纖維環(huán)各區(qū)域的不同類型細胞分化，因而有望成為纖維環(huán)組織工程的新型細胞來源。

3.2 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）

MSCs可作為纖維環(huán)再生的“種子細胞”，越來越多的研究表明骨髓和脂肪來源的MSCs均具有向椎間盤細胞分化的能力。動物實驗已證實移植MSCs具有再生潛能，可增加基質的產(chǎn)生，特別是糖胺聚糖的合成，增加椎間盤的高度和含水量[16]。幾項人體試驗用自體MSCs體外培養(yǎng)擴增后治療腰椎退變性疾病，下腰痛和脊柱功能得到明顯改善，椎間盤含水量也較治療前有顯著提高[17]。這一結果與其他干預措施（如脊柱融合術或椎間盤置換術）的結果相比更具優(yōu)勢，表明MSCs可能是治療慢性腰背痛的有效替代方法。然而，自體MSCs擴增使得該過程緩慢且昂貴，同種異體細胞在邏輯上更加方便，但可能具有移植細胞宿主免疫排斥反應的缺點。一項使用同種異體MSCs治療腰椎退變性疾病的隨機對照試驗，通過在椎間盤注射每節(jié)段25×106個同種異體MSCs，不僅緩解了疼痛，而且顯著改善了椎間盤的質量[18]。雖然MSCs在組織工程研究中取得了一定進展，但仍有許多問題亟待解決。最值得注意的問題包括：如何避免注射部位的細胞泄露、是否持續(xù)移植MSCs、缺少細胞分化標志物、是否會向椎間盤細胞分化、微環(huán)境是否對移植細胞的生存和功能產(chǎn)生影響、MSCs是否直接使組織再生、是否會誘發(fā)腫瘤形成、分泌的生物活性因子是否影響移植部位細胞的功能等，因此MSCs作為理想的候選種子細胞仍需大量的研究驗證。

共培養(yǎng)是另一種常用于促進干細胞向纖維環(huán)細胞分化的方法。當纖維環(huán)細胞和MSCs聯(lián)合培養(yǎng)時，MSCs可通過分泌生物活性因子促進纖維環(huán)細胞增殖和細胞外基質合成，同時聯(lián)合培養(yǎng)也可誘導MSCs向纖維環(huán)細胞分化。Tsai等[19]發(fā)現(xiàn)，在細胞外基質模擬支架上聯(lián)合培養(yǎng)人纖維環(huán)細胞和MSCs時可誘導MSCs向纖維環(huán)細胞系分化，分化程度與聯(lián)合培養(yǎng)比例相關，并認為用于纖維環(huán)組織工程的最佳比例為2∶1。最近的證據(jù)表明，除了分泌代謝因子，MSCs具有抗炎和抗降解性能，可用于椎間盤退變中以降低細胞因子水平，從而調節(jié)炎癥微環(huán)境，使椎間盤細胞產(chǎn)生更健康、非退變表型[20]。

3.3 纖維環(huán)組織工程支架材料

新移植的細胞受到高機械負荷，可能不利于其生存或功能。組織工程支架作為細胞附著和組織生長的一種支撐結構，是纖維環(huán)組織工程的關鍵部分。理想的支架材料既要具有纖維環(huán)組織力學性能，同時能促進細胞外基質合成。纖維支架材料包括靜電紡絲、絲素、其他天然纖維和小腸粘膜下層。由聚己內酯（polycaprolactone,PCL）制成的靜電紡絲能模擬纖維環(huán)組織的各向異性和非線性，被認為最適合纖維環(huán)細胞、MSCs細胞黏附和定向細胞外基質分泌，同時可獲良好力學性能[21]。多孔絲素支架可促進纖維環(huán)細胞的附著，以及膠原和糖胺多糖的合成[22]。使用豬的小腸粘膜下層作為生物支架，可見纖維環(huán)細胞貼壁生長良好，Ⅰ、Ⅱ和X膠原、蛋白多糖和Sox 9表達增多[23]。

其他天然材料支架包括藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂糖、膠原蛋白、蛋白多糖、脫礦骨基質等。雖然天然材料支架可以支持細胞生長，但其固有力學強度弱，因此目前研究重點在于制備具有良好機械性能的支架。而人工合成材料缺少生物活性、細胞親和力差，可能會引起組織無菌性炎癥等。復合材料在綜合性能方面明顯優(yōu)于單一材料，但現(xiàn)階段制作機械穩(wěn)定性好、生物可降解性和相容性好的復合材料有生產(chǎn)成本高、工藝復雜等不足[24]。

4 總結和展望

纖維環(huán)在椎間盤退變中的生物學作用越來越受到重視，其退變的確切機制尚待進一步研究。纖維環(huán)的修復和再生非常復雜且具有挑戰(zhàn)性，目前纖維環(huán)生物學治療研究尚處于起步階段，仍有許多問題尚未得到很好的解決。首先，纖維環(huán)細胞缺少特定的標記物，纖維環(huán)祖細胞及MSCs的定向分化培養(yǎng)尚未完全成熟。在植入之前，細胞是否需要經(jīng)過預處理或預分化以增強細胞的存活和基質的形成尚需要測試。移植細胞在惡劣的微環(huán)境中，特別是在退化椎間盤中的命運仍有待闡明。同樣，無論是直接分化還是通過旁分泌刺激宿主來源的細胞，植入細胞誘導再生的機制仍有待確定。此外，目前的生物材料支架仍無法模擬出體內的生物力學環(huán)境，而且僅能夠產(chǎn)生纖維樣組織，達不到天然組織的結構和功能特性。最后，纖維環(huán)生物學治療的遠期臨床療效和并發(fā)癥尚不清楚。隨著纖維環(huán)退變機制和組織工程學研究的深入，以及多種技術和生物材料的聯(lián)合應用，為纖維環(huán)組織的再生提供了諸多可能，利用生物治療修復退變椎間盤纖維環(huán)仍將具有廣闊的研究前景。