骨腫瘤表觀遺傳新靶標(biāo)癌組蛋白研究進(jìn)展

姜亞飛 華瑩奇 蔡鄭東

表觀修飾在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞命運(yùn)決定等眾多生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。組蛋白翻譯后修飾是一類重要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，調(diào)控著染色質(zhì)層面的遺傳信息解讀。近年來的研究表明，組蛋白自身突變會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，突變組蛋白因此被稱為“癌組蛋白”( oncohistone )。筆者立足于骨與軟組織腫瘤，圍繞癌組蛋白的突變及其表觀調(diào)控機(jī)制作一系統(tǒng)綜述。現(xiàn)報(bào)告如下。

一、組蛋白及其變體 H3.3

真核細(xì)胞中的基因表達(dá)涉及高度精密的調(diào)控過程，而染色體上結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件決定了基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)或抑制[1]。染色質(zhì)由 DNA 和核小體組成，核小體是由核心組蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4 的四個(gè)異二聚體組成的八聚體，DNA 包裹在八聚體周圍并借助連接組蛋白 H1 包裝折疊成緊密的染色質(zhì)[2]。甲基化和乙?；缺碛^修飾是組蛋白翻譯后修飾的重要部分，這些修飾依賴于特定的表觀修飾酶的催化，表觀修飾通過改變?nèi)旧|(zhì)狀態(tài)，參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而在決定生物表型及細(xì)胞命運(yùn)中起著至關(guān)重要的作用。鑒于染色質(zhì)在調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面的重要作用，許多表觀修飾酶和染色質(zhì)重塑復(fù)合物相繼被發(fā)現(xiàn)對(duì)機(jī)體發(fā)育至關(guān)重要，它們的功能在許多疾病中受到影響[3-4]。

組蛋白 H3 包括經(jīng)典的 H3.2、H3.1 及組蛋白變體H3.3。雖然 H3.3 在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上與經(jīng)典組蛋白 H3.2和 H3.1 僅存在個(gè)別氨基酸殘基的不同，但是 H3.3 在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞發(fā)育分化過程具有更加重要的功能[5]。研究表明，組蛋白 H3.3 的編碼基因 H3F3A 和 H3F3B 錯(cuò)義點(diǎn)突變與神經(jīng)系統(tǒng)及骨與軟組織腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，包括小兒高級(jí)別膠質(zhì)瘤 ( pediatric high-grade glioma，pHGGs )、骨巨細(xì)胞瘤 ( giant cell tumor of bone，GCTB ) 及軟骨母細(xì)胞瘤等[6]。在一些病例中，組蛋白突變被發(fā)現(xiàn)是腫瘤中惟一確定的復(fù)發(fā)突變，這表明組蛋白突變?cè)谀[瘤發(fā)生中可能行使著驅(qū)動(dòng)突變的重要作用[7]。已發(fā)現(xiàn)的突變多集中于特定的組蛋白編碼基因的特定位點(diǎn)，并在腫瘤類型以及腫瘤的解剖位置上具有高度特異性，這表明癌組蛋白的突變與細(xì)胞的起源可能存在一定的相關(guān)性，但目前對(duì)于癌組蛋白突變?cè)诠桥c軟組織腫瘤中的致癌機(jī)制還不是很清楚。

二、骨腫瘤中癌組蛋白突變類型

組蛋白突變主要影響特定的組蛋白 H3 變體，2012 年Nature 發(fā)文首次報(bào)道了兒童高級(jí)別膠質(zhì)瘤中癌癥組蛋白H3 編碼基因的突變，包括 Lys27Met ( K27M ) 和 Gly34Arg /Val ( G34R / V ) 等[7]。隨后的相關(guān)研究陸續(xù)報(bào)道了軟骨母細(xì)胞瘤中的 Lys36Met ( K36M ) 突變及骨巨細(xì)胞瘤中的Gly34Trp / Leu ( G34W / L ) 突變[8]。軟骨母細(xì)胞瘤是一種罕見的良性骨腫瘤，主要影響 20 歲以下的兒童和青年。而 GCTB 是相對(duì)常見的交界性骨腫瘤，常見于成年人，表現(xiàn)為溶骨性骨破壞，隨著疾病的進(jìn)展，可以引發(fā)病理性骨折、腫瘤惡變轉(zhuǎn)移等并發(fā)癥。

盡管組蛋白 H3 表達(dá)依賴于多個(gè)基因，但突變組蛋白只出現(xiàn)在特定的基因中。H3.3 由 H3F3A 和 H3F3B 共同編碼，K27M 和 G34R / V 突變發(fā)生只在 H3F3A，K36M 突變只發(fā)生在 H3F3B，而大多數(shù) H3.1 K27M 的突變發(fā)生在HIST1H3B。整體上，除了少數(shù)發(fā)生在 H3.1 和 H3.2 中，癌癥中已發(fā)現(xiàn)的組蛋白突變大部分發(fā)生在 H3.3。另外，雖然 H3F3A 和 H3F3B 編碼相同的蛋白質(zhì)，但它們的 5’ 和3’UTRs ( 非翻譯區(qū) ) 差異顯著，因此，H3F3A 和 H3F3B 轉(zhuǎn)錄形成的 mRNA 可能受到不同的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，這將進(jìn)一步導(dǎo)致 H3F3A 和 H3F3B 基因?qū)Σ煌M織中 H3.3 總量的貢獻(xiàn)產(chǎn)生差異。評(píng)估 H3F3A 和 H3F3B 在不同發(fā)育階段和不同組織中對(duì)總 H3.3 蛋白的貢獻(xiàn)，或?qū)⒂兄诶斫獠煌琀3.3 編碼基因的突變發(fā)生偏倚的原因。H3.1 和 H3.2 在染色體中的分布無顯著特異性，而 H3.3 富集在包括轉(zhuǎn)錄活性區(qū)、調(diào)控元件、異染色質(zhì)和端粒等在內(nèi)的離散的基因組區(qū)域，因此，這種類型的組蛋白變異可能對(duì)細(xì)胞生物學(xué)表型產(chǎn)生較為明顯的影響[9]。與此相對(duì)應(yīng)，H3.1 和 H3.3 突變的腫瘤在臨床表型和分子水平上均存在顯著的差異。

在骨與軟組織腫瘤中發(fā)現(xiàn)的三種突變體 ( K27、K36和 G34 ) 均位于組蛋白 H3 的 N 端尾部，該區(qū)域包含了許多不同類型的翻譯后修飾，參與調(diào)控包括基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)、DNA 修復(fù)等不同的生物學(xué)過程[10]?；诖耍P者將重點(diǎn)討論骨與軟組織腫瘤中已知的組蛋白突變體對(duì)于組蛋白H3 翻譯后修飾模式、細(xì)胞功能及腫瘤發(fā)生的影響。

三、軟骨母細(xì)胞瘤 K36M 突變

類似于 pHGGs 中的 H3 K27M 突變，組蛋白 H3 的K36M 突變也是一種腫瘤發(fā)生的驅(qū)動(dòng)突變。研究表明超過 95% 的軟骨母細(xì)胞瘤存在組蛋白 H3 K36M 突變，大多數(shù) K36M 突變發(fā)生在編碼 H3.3 的 H3F3B 基因，也有報(bào)道見于組蛋白 H3.1[11]。組蛋白 H3 上的 K36 殘基可以在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下發(fā)生單甲基化 ( H3K36me1 )、二甲基化 ( H3K36me2 ) 或三甲基化 ( H3K36me3 )[12]。哺乳動(dòng)物中，行使該催化功能的甲基轉(zhuǎn)移酶催化主要包括 NSD1、NSD2、NSD3、ASH1L 等，而 SETD2 是已知的惟一催化H3K36me2 轉(zhuǎn)化為 H3K36me3 的酶[13-14]。H3K36me2 和H3K36me3 在轉(zhuǎn)錄活性基因的基因體上富集，抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。H3K36M 突變型軟骨母細(xì)胞瘤顯示出H3K36me2 / 3 的全局缺失，分析其原因發(fā)現(xiàn)，K36M 肽或K36M 單核小體可以顯著抑制甲基轉(zhuǎn)移酶 NSD2 和 SETD2的活性，而對(duì) NSD1 和 ASH1L 無影響[15]。在間充質(zhì)祖細(xì)胞 ( mesenchymal progenitor cells，MPCs ) 中過表達(dá) H3.3 K36M，可以阻斷 MPCs 向軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞等不同譜系的分化，將表達(dá) H3.3 K36M 的 MPCs 移植到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)后會(huì)產(chǎn)生肉瘤樣改變[16]。以上結(jié)果表明，H3 K36M 突變可能是一種驅(qū)動(dòng) MPCs 的致癌蛋白。

K36M 突變通過抑制特定的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶( HMTs )，改變腫瘤基因組整體水平的表觀修飾水平，參與腫瘤的形成和進(jìn)展。同時(shí)，值得注意的是 K36M 突變型細(xì)胞的 HMTs 仍表現(xiàn)出部分剩余活性，這說明 K36M 突變體組蛋白 HMTs 活性的抑制并非完全。此外，在兒童腫瘤中尚未發(fā)現(xiàn)可以導(dǎo)致 HMTs 功能完全缺失的驅(qū)動(dòng)突變，藥物抑制 HMTs 也不能完全模擬 K36M 突變所引起的生物學(xué)表型[17]。這些結(jié)果表明，未來的研究需要確定 K36M 突變體抑制 HMTs 的實(shí)際模式，以進(jìn)一步明確其中的分子調(diào)控機(jī)制，為靶向治療指明方向。

全基因組富集分析表明，異位表達(dá) H3K36M 可導(dǎo)致 MPCs 中 H3K36me2 / 3 修飾水平的整體降低，其中對(duì)H3K36me2 的影響最為明顯[18]。H3K36me2 在 H3K36M 細(xì)胞的基因區(qū)域明顯減少。此外，表達(dá) H3K36M 的細(xì)胞基因體中的 H3K36me3 富集也顯著減少，并由此導(dǎo)致下游靶基因的表達(dá)發(fā)生變化。在內(nèi)源性 H3F3B 基因發(fā)生 H3K36M突變的永生軟骨細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果[16]。通過免疫沉淀標(biāo)記組蛋白或使用 H3K36M 特異性抗體分析組蛋白 H3 在表達(dá) H3K36M 的原代細(xì)胞中的分布，結(jié)果顯示組蛋白 H3 的分布不受 H3K36M 突變的影響，這表明該突變不影響核小體的位置。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，攜帶有 H3K36M突變的的原代細(xì)胞和軟骨母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，全基因組的H3K27me3 水平升高，因?yàn)?PRC2 的活性受到 H3K36 甲基化的抑制，當(dāng) H3K36 甲基化缺失時(shí)，便減弱了對(duì) PRC2復(fù)合體的抑制作用，并為 PRC2 提供了新的核小體底物，增加了基因組的甲基化水平[15]。攜帶有 H3K36M 細(xì)胞中H3K27me3 的增加主要見于基因間區(qū)，并與基因區(qū) PRC1富集的減少有關(guān)[19-20]?；谶@些觀察，Lu 等[15]提出H3K36M 細(xì)胞基因間區(qū) H3K27me3 的增加導(dǎo)致 PRC1 在基因組上重新分布和稀釋[21]。類似的模型也被提出來解釋多發(fā)性骨髓瘤中染色質(zhì)的變化，其 NSD2 活性的增加導(dǎo)致基因組水平 H3K36me2 水平的升高，同時(shí)抑制了 H3K27me3的水平。與此相反，另一項(xiàng)研究卻并沒有觀察到表達(dá)攜帶有 H3K36M 突變的人類軟骨細(xì)胞中 H3K27me3 水平的增加[16]。目前為止，造成這些研究存在差異的原因還不十分清楚。

四、GCTB H3G34 突變

GCTB 是一種局部侵襲性的原發(fā)性骨腫瘤，可以發(fā)生于全身任何骨骼中，但以股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端為最常見好發(fā)部位，中軸骨中，近端骶骨為最常見的部位，GCTB 是少數(shù)可以偶爾轉(zhuǎn)移到肺部的“良性”腫瘤之一[22]。由于腫瘤內(nèi)的形態(tài)學(xué)異質(zhì)性，包括繼發(fā)性動(dòng)脈瘤性骨囊腫樣的改變，廣泛的梗死伴成纖維細(xì)胞過度增生，使得 GCTB 在臨床和影像學(xué)上的診斷面臨很大的挑戰(zhàn)。組織病理學(xué)檢查，尤其是在較小的活組織檢查中，可能很難作出明確的診斷。

近年來的系列研究均顯示，超過 90% 的 GCTB 中存在組蛋白 H3.3 編碼基因 H3F3A 基因突變，其中絕大多數(shù)以第 34 位氨基酸密碼子的突變，包括 G34W / L / V / R 等。更為重要的是，突變的腫瘤成分局限于腫瘤基質(zhì)細(xì)胞而非破骨樣多核巨細(xì)胞。有研究應(yīng)用抗組蛋白 H3.3 變異位點(diǎn)的單克隆抗體輔助 GCTB 的診斷[23]，結(jié)果顯示 H3.3 G34W、G34R 和 G34V 突變體特異性抗體是鑒別 GCTB 及非 GCTB病變的有力診斷工具，具有很好的應(yīng)用價(jià)值[24-26]。

目前，關(guān)于 H3G34 突變表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)的報(bào)道還很少，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，H3 的 Gly34 殘基尚未被證明與任何表觀遺傳修飾有關(guān)，而且與 H3K27M 及 H3K36M 突變體不同，H3G34 位突變尚未被證明改變 H3 上任何氨基酸的翻譯后表觀修飾水平。然而 G34 位于 H3 尾部靠近 K36的位置，過表達(dá) H3.3G34R / V 突變時(shí)，突變體核小體上H3K36me2 和 H3K36me3 水平降低，對(duì)含有野生型組蛋白的核小體沒有影響，這表明 H3G34 位突變可能并不是主要的腫瘤驅(qū)動(dòng)突變[27]。

對(duì)與 H3K36M 肽結(jié)合的 SETD2 甲基轉(zhuǎn)移酶的晶體學(xué)研究，進(jìn)一步揭示了 H3G34 突變體對(duì)于 H3K36 甲基化修飾水平的影響的分子機(jī)制。蛋白晶體結(jié)構(gòu)研究表明H3G34 殘基深埋在 SETD2 的狹窄的催化域內(nèi)，沒有空間容納具有大側(cè)鏈的氨基酸殘基。而當(dāng)在突變的細(xì)胞中導(dǎo)入 G34 突變會(huì)影響 H3K36me3 的修飾水平，最有可能是通過改變 SETD2 結(jié)構(gòu)域的構(gòu)型所致[28]。這些結(jié)果表明，H3G34R / V 或 H3G34W / L 突變體對(duì) H3K36me3 修飾水平的影響并非特異性的，而可以被其它幾種 H3G34 突變體模擬。H3G34R / V 突變體也被證明會(huì)削弱腫瘤抑制因子ZMYND11 與 H3.3K36me3 的特異性結(jié)合[29]。H3G34W / L是否同樣影響 ZMYND11 的結(jié)合，致于 H3G34 突變?nèi)绾胃蓴_ ZMYND11 等因子與染色質(zhì)結(jié)合，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，目前尚不清楚。

近年來的研究通過建立來自 GCTB 患者的原代細(xì)胞系，分析對(duì)比野生型和 H3.3 G34W 突變型腫瘤生物學(xué)表型發(fā)現(xiàn)，H3.3 G34W 突變型原代細(xì)胞系的浸潤和增殖能力較野生型均增加，呈典型的腫瘤樣表型。原代細(xì)胞和腫瘤組織的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，突變型基因表達(dá)整體稍微下調(diào)，可能是由于染色質(zhì)致密度增加所致。通過免疫沉淀和質(zhì)譜鑒定了與 H3.3 G34W 相互作用的成分，其中最顯著的是剪切相關(guān)的 hnRNPs，轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步驗(yàn)證了染色體異常剪接的存在[30]。這些數(shù)據(jù)提示 H3.3 G34W 突變?cè)谌旧|(zhì)調(diào)控中的潛在作用，可能驅(qū)動(dòng)了 GCTB 的致瘤過程。

五、骨肉瘤中的癌組蛋白突變

骨肉瘤的基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其染色體的高度不穩(wěn)定性常導(dǎo)致非二倍體改變。變異的染色體區(qū)域往往含有細(xì)胞周期調(diào)控基因，如 TP53、RB1、c-MYC 等。這些基因的高頻突變，進(jìn)一步支持了其在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的重要作用[31-32]。

原發(fā)性骨肉瘤患者的腫瘤組織中同樣檢測(cè)出了 H3.3 G34W 突變，其總體上很少見，偶見于 30 歲以上的骨肉瘤患者。H3.3 突變骨肉瘤的臨床表現(xiàn)、組織病理學(xué)特征和其它分子特征在很大程度上尚不清楚。基于此，有研究認(rèn)為，伴有 H3.3 突變的原發(fā)性惡性骨肉瘤實(shí)際上是由惡性 GCTB 轉(zhuǎn)化而來，雖然其在病理上未見良性 GCTB的組織成分。進(jìn)一步研究運(yùn)用甲基化芯片檢測(cè)，將帶有G34W 突變的骨肉瘤與 G34W 突變型 GCTB 以及 1 例帶有K27M 突變的骨肉瘤相互比較，結(jié)果顯示帶有 G34W 突變的原發(fā)性骨肉瘤的 DNA 甲基化譜明顯不同于 H3.3 野生型骨肉瘤，但與 GCTB 更加相似，提示 G34W 突變型骨肉瘤的細(xì)胞可能是源自于 GCTB。同時(shí)，與野生型相比，H3F3A G34 突變骨肉瘤啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平更高。具體來說，研究發(fā)現(xiàn) HIST1H2BB 基因啟動(dòng)子區(qū)和 KLLN /PTEN 基因啟動(dòng)子區(qū)在 H3F3A G34 突變骨肉瘤中甲基化水平顯著升高，提示攜帶 H3F3A G34W / R 突變的骨肉瘤與KLLN / PTEN 和 HIST1H2BB 的表觀遺傳學(xué)失調(diào)有關(guān)[33]。

六、靶向癌組蛋白的表觀治療策略

骨與軟組織腫瘤中，靶向癌組蛋白的治療目前應(yīng)用的還很少，當(dāng)下的研究主要集中攜帶組蛋白突變的 pHGG，并系列研究測(cè)試了不同表觀遺傳療法的療效。系列研究對(duì)于骨與軟組織腫瘤中癌組蛋白突變的靶向治療均具有指導(dǎo)意義，故本部分對(duì)相關(guān)內(nèi)容作進(jìn)一步闡述。

為了逆轉(zhuǎn) H3K27M 腫瘤中 H3K27me3 水平的降低，Mohammad 等[17]分析了 H3K27M 突變體對(duì)于 H3K27me3去甲基酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn) JMJD3 抑制劑 GSK-J4 可以顯著抑制 H3K27me3 組蛋白去甲基化酶，導(dǎo)致 H3K27M 突變細(xì)胞系 H3K27me3 修飾水平的回復(fù)，并且證實(shí) GSK-J4對(duì)表達(dá) H3K27M 的 pHGGs 具有更加特異性的抗腫瘤活性，而對(duì)表達(dá)野生型或 G34V 突變體的細(xì)胞無明顯影響。GSK-J4 挽救 H3K27M 細(xì)胞減少的 H3K27me3 水平的分子機(jī)制尚不清楚。在另一項(xiàng)研究對(duì) DIPG 細(xì)胞系進(jìn)行了藥物篩選，發(fā)現(xiàn) panobinostat 是一種體內(nèi)外均有強(qiáng)烈抑制腫瘤生長的藥物。panobinostat 是一種非選擇性組蛋白去乙?；?( HDAC ) 抑制劑，已被批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性骨髓瘤。有趣的是，panobinostat 處理后的 H3K27M DIPG 細(xì)胞乙?；缴叩耐瑫r(shí)，H3K27me3 水平也升高，從而挽救了部分 H3K27M 誘導(dǎo)的 H3K27me3 的下降[34]。機(jī)制上，目前尚不清楚 panobinostat 治療如何影響 H3K27M 突變型腫瘤的 H3K27ac 水平，因此，panobinostat 影響腫瘤生長的機(jī)制尚不清楚。

在 GCTB 中，有研究選擇性地敲除基質(zhì)細(xì)胞中的H3.3-G34W 突變，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞的體外增殖和遷移受到了顯著的抑制，同時(shí)敲除后的細(xì)胞體內(nèi)成瘤后生長減慢，證實(shí)單一 H3.3-G34W 突變足以驅(qū)動(dòng) GCTB 的發(fā)生。同時(shí)，本研究觀察到 H3.3G34W 敲除的基質(zhì)細(xì)胞 RANKL表達(dá)降低，提示破骨細(xì)胞的形成和活性可能也會(huì)降低，從而有望延緩 GCTB 溶骨性骨破壞[35]。但基于癌組蛋白H3.3-G34W 作為 GCTB 溶骨性骨破壞的治療靶點(diǎn)，尚需進(jìn)一步深入研究。

七、總結(jié)與展望

近年來，表觀遺傳調(diào)控因子和染色體相關(guān)蛋白在腫瘤病因?qū)W中的作用越來越受到重視，在幾乎所有類型癌癥中都發(fā)現(xiàn)了頻繁的編碼表觀遺傳調(diào)控元件基因的突變。其中最新的研究揭示了組蛋白編碼基因高頻突變影響兒童腫瘤的染色體整體水平的表觀修飾，這一重要發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步加強(qiáng)了表觀遺傳變化在腫瘤發(fā)育中的關(guān)鍵作用。

癌組蛋白介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分子變化及效應(yīng)機(jī)制逐漸被揭示，這可能會(huì)為腫瘤的治療策略帶來新的發(fā)展方向。此外，深入研究癌組蛋白突變對(duì)于腫瘤分子表達(dá)譜的影響，將會(huì)為開發(fā)相應(yīng)的靶向治療藥物指明方向，具有可觀的臨床轉(zhuǎn)化前景和重要的意義。