微球體在骨組織工程中的研究進(jìn)展

崔赟謙 譚宇 吳軼群

【提要】 微球體指由天然或合成的高分子材料制成的、直徑從幾十微米到幾百微米不等的微小球體。該材料具有良好的多孔性、生物相容性、生物降解性、遞載緩釋功能以及成骨誘導(dǎo)性等優(yōu)勢，使其成為極具應(yīng)用潛能的骨組織工程材料。在骨再生過程中，微球體可為種子細(xì)胞的黏附、增殖與分化提供微環(huán)境，維系一定的立體構(gòu)型而引導(dǎo)組織細(xì)胞的遷移生長，并可作為干細(xì)胞、生長因子、藥物等的載體，更好地調(diào)控新骨形成。本文對微球體的特征及其在骨組織工程中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并展望該材料未來的應(yīng)用發(fā)展。

微球體指利用天然或合成的高分子材料，將固體或液體藥物包嵌成直徑幾十到幾百微米的微小球體。微球體材料來源廣泛，種類繁多，主要可分為天然高分子材料（如淀粉、殼聚糖等）、無機(jī)材料（如二氧化硅、羥基磷灰石等）和合成聚合物材料（如聚乳酸、聚乳酸/羥基乙酸等）。近年來，微球體已越來越多地應(yīng)用于骨組織工程中。

骨組織具有再生能力，正常情況下能自我修復(fù)并持續(xù)進(jìn)行生理性改建。但由于炎癥、腫瘤、外傷或發(fā)育畸形等引起大面積骨缺損時則很難自愈，需借助骨移植等方法進(jìn)行治療。然而，骨移植常伴隨著許多相關(guān)并發(fā)癥，如移植后供骨區(qū)易出現(xiàn)骨折、感染、疼痛，宿主免疫反應(yīng)，移植成功率低等。

微球體作為一種新型生物支架材料，具有較好的表面體積比、生物降解性、生物相容性、成骨誘導(dǎo)性以及遞載功能等優(yōu)勢，使其成為極具應(yīng)用潛能的骨組織工程材料。將其植入骨缺損區(qū)后，伴隨著骨基質(zhì)的形成和缺損區(qū)組織的重構(gòu)，微球體以與組織新生相適應(yīng)的速度逐步降解，最終被新生組織完全替換，實(shí)現(xiàn)骨再生和功能性骨的形成。在骨再生過程中，微球體可為種子細(xì)胞的黏附、增殖與分化提供微環(huán)境，維系一定的立體構(gòu)型來引導(dǎo)血管等組織細(xì)胞的遷移生長，并可作為干細(xì)胞、生長因子、藥物等的載體，更好地調(diào)控新骨形成。

本文對微球體的特征及其在骨組織工程中的應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并展望該材料未來的應(yīng)用發(fā)展的可能性。

1 微球體的特征

1.1 微球體的直徑

微球體直徑從幾十微米到幾百微米不等，其直徑受多個制備參數(shù)影響。Naito 等[1]制備的PLGA 載藥微球體直徑呈正態(tài)分布，主要集中在20～30 μm 范圍內(nèi)，平均21.07 μm。掃描電鏡觀察顯示，微球表面形態(tài)規(guī)整均勻，近似圓形。Li 等[2]用S/O/W 乳化方法制備了β-TCP 微球，當(dāng)攪拌速度為400 r/min和200 r/min 時，SEM 下可見兩種微球體直徑分別為250 μm和500 μm，表明攪拌速度可調(diào)整控制微球體大小。研究發(fā)現(xiàn)，微球體粒徑大小對藥物包封效率、產(chǎn)品注射性、藥物釋放率以及成骨效果有明顯影響。Lin 等[3]將不同尺寸的封裝了利培酮的PLGA 微球體和乙酸異丁酸蔗糖酯（SAIB）混合，研究微球體粒徑對藥物釋放率的影響。大微球體表現(xiàn)出多孔的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了藥物能更迅速地從微球體擴(kuò)散到SAIB 中。因此，含有大微球的m-SAIB 在體內(nèi)初始藥物釋放速度較快，隨后逐漸減慢。小微球內(nèi)部孔隙較少，初始藥物釋放量顯著降低，4～54 d 的藥物釋放率略有升高。Liao 等[4]研究了PLGA微球尺寸對注射CPC/PLGA 后豚鼠脛骨模型骨形成的影響。將注射磷酸鈣水泥（CPC）和PLGA 微球體兩種制劑一起注射到經(jīng)骨髓切除的脛骨髓腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)成骨效果與PLGA 微球尺寸有關(guān)。含有小直徑PLGA 微球的CPC 的骨形成總量是含有大直徑PLGA 微球的CPC 的兩倍。

1.2 微球體的孔隙形貌

不同于傳統(tǒng)微球體的實(shí)心特征，多孔微球在表面有外部孔隙，或在核內(nèi)有內(nèi)部孔隙（外部和內(nèi)部通常是互連的），活性物質(zhì)可以溶解或分散在微球表面或核內(nèi)。多孔結(jié)構(gòu)使微球體具有如下優(yōu)勢：多孔結(jié)構(gòu)具有大的比表面積和孔體積，藥物可吸附在多孔微球的表面或進(jìn)入孔道內(nèi)部，通過孔結(jié)構(gòu)的調(diào)整可實(shí)現(xiàn)藥物釋放速度的可控性；多孔結(jié)構(gòu)致使微球密度低；孔隙率在產(chǎn)能效率和釋放動力學(xué)方面起著重要作用。眾多研究證實(shí)，孔隙的直徑、數(shù)量和結(jié)構(gòu)是影響多孔微球性能的關(guān)鍵因素。Yuan 等[5]以明膠微球制備組織工程支架，發(fā)現(xiàn)支架的孔徑大小與明膠微球的大小直接相關(guān)，呈現(xiàn)出相同的大小變化趨勢，且支架的孔徑大小對不同細(xì)胞的黏附作用不同。Hossain 等[6]發(fā)現(xiàn)通過簡單地選擇玻璃配方和顆粒大小，可以很容易地控制微球孔隙度（與其表面積有關(guān)）?？紫堵实脑黾訉?dǎo)致降解過程中質(zhì)量損失的增加，并因表面積變大，使得離子釋放量增多，從而控制用于潛在生物治療離子的離子釋放速率。

1.3 生物相容性

微球體與機(jī)體的生物相容性與其本身的物理性狀（如體積、形狀、介孔大小等）及表面化學(xué)性質(zhì)（表面電荷、親水性、表面基團(tuán)種類等）密切相關(guān)。目前認(rèn)為，各種類型的微球體只要以最優(yōu)化的結(jié)構(gòu)和合適的劑量使用于機(jī)體，則可以認(rèn)為是無害的，并且可以通過表面改性賦予其更多的性能，以進(jìn)一步改善材料的生物相容性，降低對機(jī)體的毒性。Chen 等[7]采用S/O/W 技術(shù)將負(fù)載牛血清白蛋白（BSA）的卵磷脂納米顆粒，通過卵磷脂囊泡的初始自組裝和隨后的脂質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得，然后封裝到PLGA 基質(zhì)中形成復(fù)合微球。PLGA 復(fù)合微球比傳統(tǒng)的水包油（W/O/W）雙乳液法制備的聚乳酸（PLGA）微球具有更好的生物相容性，且無明顯的細(xì)胞毒性。Hsu 等[8]在PMMA微球表面制備了一層薄的磷灰石，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力比對照組有所增強(qiáng)，說明磷灰石層提高了微球?qū)Τ晒羌?xì)胞的相容性。

1.4 緩釋作用

因微球體性質(zhì)穩(wěn)定，生物相容性好，故可作為載體負(fù)載各種藥物，以實(shí)現(xiàn)藥物輸送功能，緩慢釋放藥物，釋藥結(jié)束后載體在體內(nèi)經(jīng)生物降解自行消除，這對生物活性易丟失的多肽及蛋白類藥物具有很好的實(shí)用價值。1974 年，Kramer 等[9]制備了白蛋白微球體，負(fù)載巰基嘌呤后可在體外有效釋放。微球體作為良好的緩釋系統(tǒng)可避免藥物在體內(nèi)被組織液迅速稀釋和代謝，或因酶的作用而失活，使藥物集中在靶組織附近定位釋放，提高治療效果。Zhang 等[10]將一線抗HBV 藥物恩替卡韋（ETV）包封進(jìn)PLGA 微球，研發(fā)出持續(xù)緩釋的治療乙肝的藥物輸送系統(tǒng)，從而避免乙肝患者因間斷使用抗HBV 藥物而病情加重，減少病毒反彈的機(jī)會和給藥的頻率，也可減輕每天空腹服用ETV 而導(dǎo)致的惡心、嘔吐、腹痛等不良反應(yīng)，提高患者的依從性，改善治療效果。此外，通過緩釋系統(tǒng)還可延長藥物在體內(nèi)的作用時間，更好地促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和組織再生。Qutachi 等[11]制備了一種可降解的PLGA微球，可在7 d 內(nèi)以局部有效濃度持續(xù)釋放VEGF，實(shí)現(xiàn)生理血管生成，避免因VEGF 的過度釋放而造成血管滲漏，適用于缺血性組織或傷口的治療。

為避免患者產(chǎn)生不良反應(yīng)，作為載體的微球應(yīng)有效控制藥物突釋效應(yīng)，使藥物平穩(wěn)、緩慢釋放。微球體內(nèi)部的藥物釋放取決于微球體結(jié)構(gòu)的侵蝕和破壞作用，故可通過改變微球體材料的表面離子特性或材料聚合物的結(jié)構(gòu)來改變藥物緩釋曲線。Khan 等[12]采用交聯(lián)法制備白蛋白微球，將微球的表面性質(zhì)由親水性變?yōu)槭杷裕瑥亩淖兯幬锏尼尫?。交?lián)度越高，白蛋白的溶解度越低，藥物從微球中的釋放越慢。Lei等[13]通過制備包裹生長因子的PLLA-PLGA 雙層核殼式微球來研究微球體中影響蛋白釋放的參數(shù)。研究結(jié)果表明，外殼中的蛋白質(zhì)首先釋放，再是核中的蛋白質(zhì)被釋放。此外，通過改變封裝材料的比例，可以調(diào)整核心和外殼中生長因子的釋放速率。

1.5 生物降解性

伴隨著骨基質(zhì)的形成和缺損區(qū)組織的重構(gòu)，微球體以與組織新生相適應(yīng)的速度逐步降解，最終新生組織完全置換支架材料，實(shí)現(xiàn)骨再生和功能性骨的形成。Wei 等[14]在裸鼠背部皮下注射載hBMSC 的PLGA/5SL/BMP-2 和PLGA/BMP-2 微球，進(jìn)行體內(nèi)異位骨形成試驗。HE 染色、Masson 三色染色和OCN 染色顯示，第1 周未觀察到PLGA 基微球的明顯形態(tài)變化；第8 周，部分PLGA 基微球出現(xiàn)畸形，部分間隙出現(xiàn)在PLGA 基微球中。提示PLGA 微球在體內(nèi)異位骨形成過程中緩慢降解。Wei 等[15]制備了聚羥基脂肪酸酯中空多孔微球（PHA OPMs），皮下注射入小鼠體內(nèi)，6 個月后，HE 染色發(fā)現(xiàn)PHA OPMs 降解成不規(guī)則形狀，PHA 降解主要釋放3-羥基丁酸，可促進(jìn)周圍組織的生長。研究顯示，可通過調(diào)整蛋白酶的濃度控制微球的降解速度。Annamalai 等[16]制備了明膠微球，使用不同濃度的膠原酶在37 ℃下降解微球，發(fā)現(xiàn)微球的降解呈現(xiàn)劑量依賴性。在低膠原酶濃度（1.0 g/mL）下，微球的降解可忽略不計（觀察時間超過48 h）。在高膠原濃度（7.5 mg/mL和10 mg/mL）下，微球降解速度非常快，隨后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)膠原酶濃度為5.0 mg/mL 時，微球降解穩(wěn)定且持續(xù)時間超過48 h。

1.6 抗感染特征

植骨區(qū)感染是造成植骨失敗的重要原因。研究顯示可通過在微球體中添加各類抗炎癥成分來增強(qiáng)微球體的抗感染性能。小檗堿（Bbr）是一種水溶性異喹啉生物堿，具有抗真菌、抗炎、抗菌等生物藥理作用。Cai 等[17]將CMCSM、Bbr/CMCSM 微球體分別和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)24 h，通過觀察材料周圍藥物擴(kuò)散而抑制細(xì)菌引起的圓環(huán)來進(jìn)行評價。CMCSM 組未觀察到明顯的抑菌環(huán)；而Bbr/CMCSM 組培養(yǎng)皿中央出現(xiàn)抑制區(qū)，表明Bbr 有顯著的抗菌活性。Wei 等[18]制備了表面負(fù)載納米銀和磷灰石的微球，研究其抗菌性能。將微球和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)24 h 后，出現(xiàn)了明顯的抑制區(qū)，展現(xiàn)了良好的抗菌作用，其抗菌活性主要來自微球中銀離子的持續(xù)釋放。后進(jìn)行體內(nèi)試驗，制備SD 大鼠感染顱骨缺損模型（φ=8 mm）。植入微球體術(shù)后1 個月，與對照組相比，表面負(fù)載納米銀和磷灰石的微球組感染明顯減輕，HE 染色顯示成骨效果更好，證實(shí)了表面負(fù)載納米銀和磷灰石的微球確實(shí)能有效治療有感染風(fēng)險的骨缺損。Qiao 等[19]將PLGA 微球體包封莫西沙星，在體外能緩慢釋放莫西沙星。實(shí)驗證明MOXPLGA 微球具有較強(qiáng)的抗菌活性和抗菌生物膜抑制性能，因此新型MOX-PLGA 微球可作為治療骨髓炎的良好載體。

2 微球體在骨組織工程中的研究及應(yīng)用

微球支架在骨組織工程中的應(yīng)用已引起了廣泛的關(guān)注。微球體在理化性能上很好地模擬了天然的骨細(xì)胞外基質(zhì)，能促進(jìn)成骨過程[20]。Borden 等[21]將可生物降解PLGA 微球制備成微球支架，所制備的支架具有30%～40%的孔隙率，孔隙互連度為100%，可作為松質(zhì)骨再生的模板；抗壓強(qiáng)度范圍在130～300 MPa 之間，適用于骨再生。此外，細(xì)胞實(shí)驗表明，骨髓干細(xì)胞可在相鄰微球體孔隙周圍的同心圓間形成有張力的細(xì)胞質(zhì)連接[22]。由于天然的球形結(jié)構(gòu)，微球支架修復(fù)再生組織的方式與由排列在中央哈弗氏管周圍、同心圓樣的礦化膠原片所組成的骨小梁十分相似[20]。

在現(xiàn)有的方法中，生物活性玻璃與可降解聚合物的組合方式備受關(guān)注[23]。該方法能充分發(fā)揮生物玻璃的骨再生性能和可降解聚合物的球化能力?；钚噪x子如鈣、磷酸鹽和硅可以從玻璃成分中釋放出來，并影響細(xì)胞功能，如細(xì)胞增殖、分化和礦化[24]。因此，離子控制成骨功能被認(rèn)為是使用生物活性玻璃與聚合物復(fù)合微球的一個重要優(yōu)點(diǎn)。研究證明，磷酸鈣和磷酸三鈣（TCP）可以加入微球支架中，加入的陶瓷增強(qiáng)了與骨組織相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分的分泌，刺激細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[25-26]。Bo Li 等[2]制備了可注射的β-TCP 微球，在兩周的測試期間微球持續(xù)釋放Ca2+，顯示良好的生物降解性并提供鈣來源。β-TCP 微球有效提高了BMSC 骨基因（OCN、RUNX2）的表達(dá)，證實(shí)微球可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化。將聯(lián)合培養(yǎng)的BMSC 和微球成功植入8 周齡裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)β-TCP微球可形成一個誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和骨再生的微環(huán)境，這意味著β-TCP 微球作為骨替代材料有著潛在的應(yīng)用前景，可修復(fù)形狀不規(guī)則的骨缺損。

微球體不僅可以支撐缺損空間作為組織工程骨再生的框架，也能通過遞載各類分子離子、生長因子及藥物更好地調(diào)控新骨形成。

在微球體中摻雜鋅、鍶等元素，有利于促進(jìn)成骨并修復(fù)骨缺損。研究表明，鍶通過降低破骨細(xì)胞活性、增加破骨細(xì)胞凋亡，同時增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性、減少成骨細(xì)胞凋亡來減少骨吸收[27-29]。Henriques 等[30]在Hap 微球中摻雜鍶，實(shí)驗發(fā)現(xiàn)在骨缺損模型中，含鍶微球組比不含鍶微球組更早地形成新骨，生成新骨的體積更多且外形愈合更良好。

通過微球體負(fù)載生長因子促進(jìn)組織工程骨再生也是近年來研究的熱點(diǎn)之一。BMP-2 是轉(zhuǎn)化生長因子超家族（TGFβ）的成員，對骨形成有刺激作用。然而，盡管BMP-2 具有很強(qiáng)的骨誘導(dǎo)活性，但由于缺乏合適的遞送系統(tǒng)，其臨床應(yīng)用受到限制[31]。Lee 等[32]制備了負(fù)載BMP-2 的PLGA 微球體，并將其制作成3D 支架，研究成骨效果。將負(fù)載BMP-2 的支架和未負(fù)載BMP-2 的支架分別與MC3T3-E1 共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)負(fù)載BMP-2 支架組中骨組織相關(guān)基因ALP、OCN 以及COL-1的表達(dá)均更高。同時，體內(nèi)實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，負(fù)載BMP-2 支架相比對照組可提供更好的骨再生環(huán)境，大鼠顱骨骨缺損區(qū)域減小，骨形成區(qū)迅速增加。Zhang 等[33]將BMP-2 模擬肽P24 負(fù)載至PLLA 基微球，并與兔BMSC 混合，皮下注射至裸鼠體內(nèi)。同空白對照的PLLA 基微球相比，偶聯(lián)P24 的PLLA 基微球具有生物學(xué)功能，在誘導(dǎo)兔BMSC 成骨分化及異位骨形成方面有良好的成骨特性。

糖皮質(zhì)激素對于誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化和形成礦化細(xì)胞外基質(zhì)有著重要的影響。Dawes 等[34]制備了載地塞米松PLGA微球，分別以不同濃度與SV-HFO 細(xì)胞共培養(yǎng)，經(jīng)過7 d 的孵育，ALP 活性表達(dá)強(qiáng)烈，茜素紅染色發(fā)現(xiàn)基質(zhì)礦化隨微球濃度的增加而增加，證實(shí)了負(fù)載地塞米松的PLGA 微球通過地塞米松的持續(xù)釋放誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。辛伐他汀具有成骨和成血管活性，Yu 等[35]研究了負(fù)載辛伐他汀的介孔羥基磷灰石（S-MHMs）對大鼠BMSC 成骨分化及新生血管生成的影響。結(jié)果表明，S-MHMs 能同時促進(jìn)骨再生和新生血管形成，在骨缺損修復(fù)方面具有巨大的潛力。Li 等[36]的研究表明，負(fù)載姜黃素PLGA 微球可以通過減輕線粒體功能障礙，調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/HO-1 信號通路，抑制糖尿病誘導(dǎo)的活性氧生成。因此，糖尿病對BMSC 增殖、遷移和成骨分化的負(fù)面影響也明顯減輕。將負(fù)載姜黃素PLGA 微球植入2 型糖尿病大鼠骨缺損，與單純支架植入相比，前者顯示出更強(qiáng)的成骨能力。

骨再生治療方法的成功與否取決于支架內(nèi)血管的浸潤程度[37]。為進(jìn)一步驗證微球體在骨再生方面的潛力，Jabbarzadeh等[38-39]證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞在微球支架上表現(xiàn)出正常的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能表型，說明微球體植入體內(nèi)時能支持血管的形成，促進(jìn)周圍組織的血管浸潤。Boldbaatar 等[40]制備了摻鈷的硅酸鹽微球，可持續(xù)釋放雙離子（硅酸鹽和鈷），被證明可協(xié)同上調(diào)血管生成的關(guān)鍵基因，如HIF1 -α、VEGF 及KDR 等。離子的摻入促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的極化、遷移、歸巢和新生血管的生成。

3 小結(jié)

微球體具有良好的多孔性、生物相容性、機(jī)械學(xué)性能、緩釋功能、生物可降解性，作為骨組織工程中的新型支架材料，為修復(fù)骨缺損提供了新思路。與傳統(tǒng)組織工程支架相比，微球支架有許多優(yōu)勢：①多孔網(wǎng)絡(luò)；②緩釋生物活性因子和藥物；③可注射性及可塑性使其在微創(chuàng)手術(shù)中有應(yīng)用潛力。但尚存一些不足，有待進(jìn)一步研究解決：微球的制備過程影響因素較多，微球粒徑大小、微孔的形態(tài)與孔徑大小等不能精確控制；微球的載藥率和包封率相對較低；制備過程中采用的致孔劑、有機(jī)溶劑等未能從產(chǎn)品中徹底除去等。隨著研究的不斷深入，新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，微球體在骨組織工程中的應(yīng)用將越來越廣泛。