利用生物三維打印技術(shù)修復(fù)軟骨損傷的研究進(jìn)展

韓倩倩 王苗苗 史建峰 王迎 連環(huán) 王蕊 李靜莉 王春仁

【提要】 軟骨組織因缺乏血供，自我修復(fù)能力極其有限，導(dǎo)致軟骨損傷后難以再生修復(fù)。生物三維打印技術(shù)突破了傳統(tǒng)組織工程技術(shù)仿生功能設(shè)計(jì)的局限性，可一體化成型并精確制備復(fù)雜結(jié)構(gòu)，還可以將細(xì)胞打印于支架材料中，構(gòu)建適合細(xì)胞生存的微環(huán)境，在軟骨修復(fù)和再生領(lǐng)域具有優(yōu)勢。本文對生物三維打印技術(shù)修復(fù)軟骨的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

生物三維打印是三維打印在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個分支。生物三維打?。˙io-3DP）是采用生物材料、細(xì)胞或生長因子等活性物質(zhì)進(jìn)行打印，目的是為了構(gòu)建復(fù)雜的生物三維結(jié)構(gòu)，并使其具有生物活性，最終獲得與目標(biāo)組織或生物器官接近、相同甚至更優(yōu)越的功能。目前，生物三維打印技術(shù)主要包括擠出式、低溫沉積、細(xì)胞打印等[1]。

全球3D 打印行業(yè)中，歐美最為發(fā)達(dá)，美國的3D 打印已形成了產(chǎn)業(yè)化[2]。我國政府十分重視3D 打印產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，將其作為《中國制造2025》的重點(diǎn)發(fā)展項(xiàng)目之一。2017 年，工業(yè)和信息部等12 個部門聯(lián)合印發(fā) 《增材制造產(chǎn)業(yè)發(fā)展行動技術(shù)（2017～2020 年）》，提出至2020 年我國增材制造產(chǎn)業(yè)年銷售收入超200 億元，關(guān)鍵核心技術(shù)達(dá)到國際水平，工藝裝備基本滿足行業(yè)需求，在部分領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)規(guī)模化應(yīng)用，推進(jìn)增材制造在各制造領(lǐng)域的示范性應(yīng)用[3]。但與美國等達(dá)國家相比，我國仍處于3D 打印技術(shù)的起步階段，需要進(jìn)一步突破。

1 軟骨修復(fù)的重要性及現(xiàn)階段難點(diǎn)

我國每年因?yàn)榧膊?、意外等?dǎo)致骨折或骨損傷的人數(shù)日益增多，加上物質(zhì)生活水平的提高，肥胖導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨磨損患者也日益增多。軟骨中的細(xì)胞外基質(zhì)（軟骨基質(zhì)）富含Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖，在生理軟骨中形成致密的網(wǎng)狀物，含有大量的水，產(chǎn)生足夠的機(jī)械強(qiáng)度[4]。疾病或各種損傷引起的骨、軟骨、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷可導(dǎo)致人體功能缺陷，盡管骨組織具有強(qiáng)大的自愈能力，但僅可在一定的缺損范圍內(nèi)發(fā)揮作用[5]。軟骨組織沒有血供系統(tǒng)，只能依賴關(guān)節(jié)液提供養(yǎng)分，限制了軟骨組織的自我修復(fù)[6]。

軟骨缺損的修復(fù)一般采用藥物、手術(shù)、物理等治療方法，但均存有不足。例如，藥物治療主要是通過口服或關(guān)節(jié)腔注射給藥，僅可部分減輕因關(guān)節(jié)軟骨損傷而引發(fā)的疼痛，總體治療效果有限，僅對輕度損傷有效，且副作用較為強(qiáng)烈，不適宜長期使用。物理治療所需時間長且效果有限，與其他方法相比不具有明顯優(yōu)勢，一般只作為輔助治療方法。手術(shù)方法種類較多，包括軟骨下骨鉆孔術(shù)、鑲嵌成形術(shù)、自體骨軟骨移植、同種異體移植、異體骨軟骨移植、攝取特殊軟骨促進(jìn)自體軟骨再生等，其中自體骨軟骨移植現(xiàn)被認(rèn)為是臨床治療的金標(biāo)準(zhǔn)[7]。治療方法通常根據(jù)年齡、性別、受傷部位以及損傷的直徑和深度等因素進(jìn)行選擇。許多患者通常需要關(guān)節(jié)鏡手術(shù)甚至關(guān)節(jié)置換術(shù)。上述手術(shù)方法還存有免疫排斥、術(shù)后關(guān)節(jié)炎癥、術(shù)后效果不理想等問題。軟骨修復(fù)至今仍然是臨床面對的一個巨大的挑戰(zhàn)[8-9]。

上世紀(jì)80 年代以來，組織工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為這一難題的解決提供了新的可能性。組織工程從理論上建立了一種治療軟骨缺損的理想方法，但至今仍有部分關(guān)鍵問題亟待解決，還無法真正地應(yīng)用于臨床[10]。

2 生物三維打印技術(shù)在軟骨修復(fù)領(lǐng)域的優(yōu)勢

生物三維打印技術(shù)突破了傳統(tǒng)組織工程技術(shù)生物功能設(shè)計(jì)的局限性，可精確控制細(xì)胞在支架材料中的定點(diǎn)分布，微觀上構(gòu)建具有適合細(xì)胞生存的微環(huán)境，為細(xì)胞提供真正的三維均衡生長環(huán)境，使得骨軟骨再生成為可能。生物3D 打印技術(shù)發(fā)展迅猛，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，三維打印技術(shù)因其快速成型和構(gòu)建復(fù)雜形狀的能力表現(xiàn)出無可比擬的優(yōu)勢[11]。在骨科領(lǐng)域，可將患者虛擬的影像迅速轉(zhuǎn)換成三維實(shí)體物件，也可以實(shí)現(xiàn)材料結(jié)構(gòu)的個性化定制以及與病變部位的解剖學(xué)匹配，已廣泛應(yīng)用于骨科疾病的診斷、治療和康復(fù)。尤為重要的是，三維組裝細(xì)胞和材料的生物打印技術(shù)使組織再生修復(fù)更有效率，具有廣闊的應(yīng)用前景[12]。

軟骨的修復(fù)不僅是軟骨層，也包含軟骨和松質(zhì)骨之間的過度結(jié)構(gòu)的修復(fù)。生物三維打印可以制備復(fù)合材料和梯度成分的多層次復(fù)雜結(jié)構(gòu)的支架材料，借助生物三維打印機(jī)對損傷部位進(jìn)行針對性、個性化打印，這種復(fù)合梯度材料將有助于軟骨的多層結(jié)構(gòu)的修復(fù)。與以往的骨及軟骨修復(fù)材料相比，生物三維打印的骨及軟骨的組織工程支架具有生物相容性好、免疫排斥低、精度高等優(yōu)點(diǎn)，可能是今后臨床進(jìn)行軟骨缺損修復(fù)的完美手段。

3 利用生物三維打印技術(shù)進(jìn)行軟骨修復(fù)的生物材料

3.1 天然高分子修復(fù)材料

纖維蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白、藻酸鹽、殼聚糖（CTS）、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、瓊脂糖等材料，均具有良好的生物相容性，其降解產(chǎn)物可被機(jī)體代謝吸收，但具有降解速率過快、力學(xué)強(qiáng)度低等缺點(diǎn)[7]。

3.2 人工合成高分子修復(fù)材料

聚己酸內(nèi)酯（PCL）、聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）、β-磷酸三鈣（β-TCP）和羥基磷灰石（HA）等常用于軟骨缺損的修復(fù)。這類修復(fù)材料具有相對分子質(zhì)量滿足不同需求、機(jī)械性能優(yōu)異、生物相容性良好和易塑性等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是親水性較差。

3.3 復(fù)合修復(fù)材料

復(fù)合材料是由具有良好生物相容性的天然高分子材料與具有優(yōu)異機(jī)械性能的人工合成高分子材料制得的復(fù)合而成，可以起到優(yōu)勢互補(bǔ)的作用，如聚氨酯/透明質(zhì)酸、脫乙酰殼聚糖-明膠凝膠支架等[13]。

3.4 納米材料

納米相陶瓷、碳納米管等材料在軟骨組織工程的應(yīng)用已有大量報(bào)道。相關(guān)研究表明，納米材料在軟骨組織工程領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用前景。例如，納米相陶瓷，特別是納米羥基磷灰石，由于它能促進(jìn)礦化的形成，而成為骨的替代材料。羥基磷灰石納米晶體與膠原成分組成的復(fù)合材料是最接近天然骨結(jié)構(gòu)的組織工程材料。軟骨是由軟骨細(xì)胞和膠原纖維、蛋白多糖以及彈性蛋白纖維組裝的高密度納米結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)組成，再生能力較低。而納米技術(shù)對傳統(tǒng)的軟骨組織工程材料進(jìn)行改造，產(chǎn)生納米組織工程材料，是生物仿生支架的一種，具有獨(dú)特的生物學(xué)性能。應(yīng)用在骨和軟骨組織工程中的納米材料不僅需要良好的機(jī)械性能，還需具有能提高骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞功能的納米結(jié)構(gòu)[14]。

4 利用生物三維打印技術(shù)修復(fù)軟骨的國內(nèi)外研究進(jìn)展

利用三維打印技術(shù)制備軟骨修復(fù)支架材料是構(gòu)建人工軟骨的核心，也是軟骨組織工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

4.1 國外研究現(xiàn)狀

Yi 等[15]通過整合三維打印技術(shù)和組織工程方法，建立了以計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)系列程序?yàn)榛A(chǔ)，生成定制鼻腔植入物的三維模型，并通過3D 打印機(jī)進(jìn)行模型的制作。Liu 等[16]將動態(tài)液體靜電紡絲制造的取向聚（L-乳酸）-聚（ε-己內(nèi)酯）P（LLA-CL）/Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）納米纖維紗網(wǎng)作為冷凍干燥的膠原Ⅰ/透明質(zhì)酸（HA）軟骨相（海綿）的骨架，以提高支架的機(jī)械強(qiáng)度。體外結(jié)果顯示，Yarn Col-I/HA 雜合支架（Yarn-CH）可以象海綿支架一樣使細(xì)胞浸潤。使用多孔β-TCP 作為骨相，然后通過冷凍干燥組裝Yarn-CH/TCP 雙相支架。結(jié)合BMSC 后，雙相復(fù)合物成功用于修復(fù)兔軟骨缺損。Yang 等[17]將與海藻酸鈉混合的Ⅰ型膠原或瓊脂糖摻入軟骨細(xì)胞以構(gòu)建體外3D 打印的軟骨組織，海藻酸鈉/Ⅰ型膠原有效抑制了軟骨細(xì)胞的去分化，保留了表型。You 等[18]使用補(bǔ)充有熱/浸沒離子交聯(lián)過程的3D 生物繪圖技術(shù)來制造6 種水凝膠支架幾何形狀，并研究了它們對機(jī)械性能的影響。結(jié)果表明，水凝膠支架的機(jī)械性能可以通過改變內(nèi)部結(jié)構(gòu)參數(shù)來調(diào)整，包括股線方向和股線之間的間距。Ahn 等[19]將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽固定在聚丙烯富馬酸酯（PPF）支架上，用于調(diào)節(jié)支架上細(xì)胞之間的相互作用。顯微鏡觀察和組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，支架上細(xì)胞正常增殖，說明具有固定化RGD 肽的基于PPF 的生物相容性支架可有效支持人軟骨細(xì)胞的初始黏附和增殖。這種3D 生物可印刷支架可提供促進(jìn)軟骨組織再生的機(jī)會。Markstedt 等[20]結(jié)合納米原纖化纖維素（NFC）的突出的剪切稀化特性和海藻酸鹽的快速交聯(lián)能力，將其用于具有細(xì)胞的活體軟組織的3D 生物打印，證明了納米纖維素在活組織和器官3D 生物打印中的潛在用途。Kon 等[21]等將切碎的自體軟骨片段加載到由透明質(zhì)酸（HA）衍生的膜、富含血小板的纖維蛋白基質(zhì)（PRFM）和纖維蛋白膠組成的支架上。研究的目的是在體外證明軟骨細(xì)胞從軟骨碎片向這個支架的生長，并在山羊骨軟骨缺損中達(dá)到功能性修復(fù)。

4.2 國內(nèi)研究現(xiàn)狀

王瑩瑩等[22]構(gòu)建一種脫細(xì)胞軟骨/GelMA 復(fù)合材料支架用于修復(fù)軟骨缺損，該材料溶脹率低，力學(xué)強(qiáng)度稍強(qiáng)，BMSC能在支架上黏附并增殖；通過可注射型脫細(xì)胞軟骨/GelMA 復(fù)合材料制備的支架具有低免疫原性，適宜的儲能模量，良好的生物相容性，適用于軟骨修復(fù)。毛景洋等[23]發(fā)明了一種可直接3D 打印的氫鍵增強(qiáng)的高強(qiáng)度水凝膠墨水，并且模擬軟骨-骨的一體化結(jié)構(gòu)，利用多噴頭交替打印制備成底層含有β-TCP、頂部含有若干層負(fù)載生長因子TGF-β1 的梯度支架。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，該雜化梯度水凝膠支架可同時促進(jìn)軟骨和軟骨下骨再生。林祥龍等[24]在壓縮應(yīng)變下，將絲素蛋白/Ⅱ型膠原蛋白復(fù)合支架與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果表明，在10%的壓縮應(yīng)變作用下，軟骨細(xì)胞在絲素蛋白/Ⅱ型膠原蛋白復(fù)合支架上增殖良好，該支架可用于修復(fù)軟骨缺損。黃彰等[25]將BMSC 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞與聚乙醇酸-乳酸共聚物（PLGA）-Ⅱ型膠原支架通過管帽結(jié)構(gòu)復(fù)合，構(gòu)建組織工程軟骨復(fù)合體，有效修復(fù)了兔膝關(guān)節(jié)骨、軟骨損傷，新生軟骨、骨與宿主軟骨、骨及新生軟骨與軟骨下骨各界面耦合良好。彭晨健等[26]的研究表明，3D 打印β-磷酸三鈣復(fù)合淫羊藿苷支架植入股骨頭壞死的兔體內(nèi)，可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化、抑制破骨細(xì)胞活性，同時促進(jìn)新生血管生成，具有促進(jìn)兔股骨頭壞死修復(fù)的作用。徐燕等[27]的研究顯示，采用3D 打印技術(shù)制備經(jīng)多巴胺表面修飾及負(fù)載CDMP-1 的PCL-HA 三維多孔支架，體外與hBMSC共培養(yǎng)，可促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖及成軟骨分化。阮世強(qiáng)等[28]將雙層聚乳酸/聚羥基乙酸共聚物支架材料復(fù)合慢病毒介導(dǎo)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 轉(zhuǎn)染的兔脂肪干細(xì)胞修復(fù)骨、軟骨缺損。結(jié)果可顯著促進(jìn)骨、軟骨缺損的修復(fù)。

5 總結(jié)

生物三維打印為多組分、多梯度的復(fù)合材料的制備提供了新的技術(shù)方法，同時可以制備復(fù)雜結(jié)構(gòu)和個性化結(jié)構(gòu)，為軟骨修復(fù)提供了新的策略。