基于一測多評法的白術飲片成分含量測定

伍蕊嗣， 劉 濤， 梁 悅， 周蔚昕， 寇 強， 張 佳

(成都大學 藥學與生物工程學院， 四川 成都 610106)

0 引 言

白術為菊科植物白術的干燥根莖，主要含揮發(fā)油、內(nèi)酯類和多糖類成分，具有健脾益氣、燥濕利水等功能，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主產(chǎn)于浙江、安徽、淮北、皖南等地[1].《中國藥典》2015年版一部中白術項下無含量測定項，難以體現(xiàn)和保障白術的內(nèi)在品質及其相關制劑的質量[2].目前雖已有以多個成分同步測定或利用液相指紋圖譜來控制白術質量的相關報道，但由于化學對照品緊缺、價格昂貴且不穩(wěn)定，而利用指紋圖譜無法定量測定白術含量，這些都限制了這些質控模式的實際應用[3-6].此前，有學者提出一測多評法，即只采用一個對照品實現(xiàn)對藥材多種成分含量的同步測定[7-9].因該法具有代表性而被《中國藥典》2015 年版一部收載，并在丹參、人參、黃連等藥材中得到應用.基于此，本研究擬采用一測多評法，以白術內(nèi)酯I、白術內(nèi)酯III和蒼術酮多個有效成分為指標對白術飲片進行多成分含量測定，利用一個白術內(nèi)酯III為對照品，通過相對校正因子的計算，同步實現(xiàn)多成分(白術內(nèi)酯I、蒼術酮)的含量測定，擬為白術質量標準的可控提供技術保障.

1 材料與儀器

1.1 材 料

1)實驗所用白術為本實驗室2017年從浙江、四川、河北購買的13批栽培品，樣品經(jīng)成都大學藥學與工程學院劉濤研究員鑒定為菊科植物白術的干燥根莖.

2)實驗所用的試劑包括：白術內(nèi)酯I(批號，wkq16052904，純度≥98%)、白術內(nèi)酯III(批號，wkq16092604，純度≥98%)，購自四川省維克奇生物科技有限公司；蒼術酮(批號，170107，純度為85%，計算時按100%折算)，購自成都植標化純生物技術有限公司.實驗所用甲醇、乙腈為色譜純，水為怡寶純凈水，其余試劑均為分析純.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：P230Ⅱ型高效液相色譜儀、Ichrom 5100型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；FA2004型分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；HS-3120型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司).

2 方法與結果

2.1 方法學考察

2.1.1 色譜條件.

本研究參照相關文獻對白術飲片一測多評法的色譜條件(流動相、檢測波長)進行了考察，最終確定實驗的色譜條件為：依利特Supersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)—水溶液(B)；梯度洗脫程序為，0～20 min，62% A，20～21 min，62%～80% A，21～40 min，80% A，40～41 min，80%～62% A，41～50 min，62% A；流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長220 nm，進樣量10 μL.在以上色譜條件下，蒼術酮、白術內(nèi)酯I、白術內(nèi)酯III分離度良好，結果如圖1所示.

1.白術內(nèi)酯III； 2.白術內(nèi)酯I； 3.蒼術酮

圖1對照品(A)和供試品(B)的高效液相色譜圖

2.1.2 混合對照品溶液的制備.

精密稱定蒼術酮、白術內(nèi)酯I、白術內(nèi)酯III對照品適量，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，配制成濃度分別為0.6848 mg/mL、0.8488 mg/mL及0.6343 mg/mL的單一對照品溶液.

精密吸取以上3種對照品溶液，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度分別為0.0240 mg/mL、0.0170 mg/mL及0.1097 mg/mL的混合對照品溶液.

精密吸取1.0 mL混合對照品溶液4份，分別置于5、10、25、50 mL容量瓶中，加甲醇定容搖勻，依次作為混合對照品溶液2～5.

2.1.3 供試品溶液的制備.

取白術粉末(過2號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，稱定質量，超聲處理10 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，作為供試品溶液.

2.1.4 線性關系考察.

取“2.1.2"項下 5 個濃度梯度的混合對照品溶液，按照“2.1.1"項下的色譜條件.對峰面積(Y)和進樣量(X)進行線性回歸，分別得到蒼術酮、白術內(nèi)酯I、白術內(nèi)酯III的回歸方程及線性范圍(見表1).結果表明，混合對照品溶液在各自線性范圍內(nèi)線性關系良好.

表1 白術飲片中3個成分的標準曲線

2.1.5 精密度.

按照“2.1.1"項下的色譜條件，連續(xù)進樣混合對照品溶液2號6次，蒼術酮、白術內(nèi)酯I和白術內(nèi)酯III峰面積的RSD分別為0.93%、2.42%、1.37%.結果表明，儀器的精密度良好.

2.1.6 穩(wěn)定性.

按照“2.1.3"項下的方法制備供試品溶液，于樣品制備后的第0、2、4、6、8、12 h，在“2.1.1"項的色譜條件下進行測定，蒼術酮、白術內(nèi)酯I和白術內(nèi)酯III峰面積的RSD分別為4.78%、4.77%、4.70%.結果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.1.7 重復性.

按照“2.1.3"項下的方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1"項的色譜條件下進行測定，蒼術酮、白術內(nèi)酯I和白術內(nèi)酯III含量的RSD分別為1.70%、3.32%、1.70%.結果表明，方法的重復性良好.

2.1.8 加樣回收.

取已知含量的白術粉末(過二號篩)約0.25 g，精密稱定，按含量—對照品(1∶1) 的比例分別加入3種對照品溶液適量，按照“2.1.3"項下的方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1"項的色譜條件下進行測定，蒼術酮、白術內(nèi)酯I和白術內(nèi)酯III的加樣回收率分別為105.22%、104.60%、94.92%，含量的RSD分別為1.45%、2.44%、4.59%.結果表明，方法的回收率良好.

表2 加樣回收實驗結果

2.2 相對校正因子確定

依據(jù)相關計算公式，分別計算白術內(nèi)酯I和蒼術酮相對于白術內(nèi)酯III(內(nèi)參物)的相對校正因子，結果見表3.

表3 白術飲片中3個成分相對校正因子

2.3 白術飲片一測多評法的適應性評價

2.3.1 不同儀器的影響.

在同一實驗室，采用同一色譜柱(依利特Supersil C18)，考察了2種高效液相色譜儀(P230II型、Ichrom 5100型)對相對校正因子的影響，結果見表4.數(shù)據(jù)顯示，f白術內(nèi)酯Ⅰ/白術內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術酮/白術內(nèi)酯Ⅲ的RSD均小于5 %.結果表明，相對校正因子在這2種高效液相色譜儀下重復性良好.

表4 2種高效色譜儀測得相對校正因子

2.3.2 不同色譜柱的影響.

在同一實驗室，采用2種高效液相色譜儀(P230II型、Ichrom 5100型)，分別考察了2種色譜柱(依利特Supersil C18、Global GS-120-5-C18-AP)對相對校正因子的影響，結果見表5、6.

表5 不同色譜柱測得相對校正因子——P230Ⅱ

表6 不同色譜柱測得相對校正因子——Ichrom 5100

表5、6數(shù)據(jù)顯示，f白術內(nèi)酯Ⅰ/白術內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術酮/白術內(nèi)酯Ⅲ的RSD均小于2%.結果表明，相對校正因子在這2種高效液相色譜儀下2種色譜柱間的重現(xiàn)性良好.

2.3.3 不同柱溫的影響.

在同一實驗室，采用同一色譜柱(依利特Supersil C18)，在同一高效液相色譜儀(Ichrom 5100型)下，考察3種柱溫(30、35、40 ℃)對相對校正因子的影響，結果見表7.

表7 不同柱溫對相對校正因子的影響

表7數(shù)據(jù)顯示，f白術內(nèi)酯Ⅰ/白術內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術酮/白術內(nèi)酯Ⅲ的RSD均小于2%.結果表明，各成分相對校正因子重現(xiàn)性良好.

2.3.4 不同流速的影響.

在同一實驗室，采用同一色譜柱(依利特Supersil C18)，在同一高效液相色譜儀(Ichrom 5100型)下，考察了3種流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)對相對校正因子的影響，結果見表8.

表8 不同流速對相對校正因子的影響

表8數(shù)據(jù)顯示，f白術內(nèi)酯Ⅰ/白術內(nèi)酯Ⅲ、f蒼術酮/白術內(nèi)酯Ⅲ的RSD均小于3%.結果表明，各成分相對校正因子重現(xiàn)性良好.

2.4 一測多評法待測色譜峰的定位

在同一實驗室，分別考察了2種高效液相色譜儀(P230Ⅱ型、Ichrom 5100型)，2種色譜柱(依利特Supersil C18、Global GS-120-5-C18-AP)下相對保留值和相對時間差的重現(xiàn)性，結果見表9、10.

表9 一測多評法待測成分色譜峰的定位(相對保留值)

表10 一測多評法待測成分色譜峰的定位(相對時間差)

表9、10數(shù)據(jù)顯示，相對保留值(RSD<2%)較相對時間差(RSD<4%)更能定位色譜峰.

2.5 一測多評法與外標法測定結果的比較

按照“2.1.3"項下的方法制備供試品溶液，在“2.1.1"項的色譜條件下，采用外標法測得白術內(nèi)酯III的含量，再通過一測多評法與外標法測得蒼術酮和白術內(nèi)酯I的含量，將兩種方法所得結果進行比較，結果見表11.

表11 外標法與一測多評法測定白術飲片中3種成分結果比較

由表11數(shù)據(jù)可見，在13批白術飲片中，2種方法所測得成分含量的RSD均小于5%.此表明，本研究建立的一測多評法能替代外標法對白術飲片進行含量控制.

3 討 論

白術作為臨床常用中藥，一直是行業(yè)研究的重點，而《中國藥典》2015年版一部中白術無含量測定項的收載.目前，還沒有發(fā)現(xiàn)對白術飲片利用一測多評法的報道，只有多成分同時測定和液相指紋圖譜的相關研究.但由于化學對照品緊缺和價格昂貴，指紋圖譜無法定量測定含量，限制了這些質控模式的實際應用.

蒼術酮、白術內(nèi)酯I、白術內(nèi)酯II、白術內(nèi)酯III是白術中的主要特征性成分，藥理活性顯著，且與白術的功效具有相關性，是評價白術飲片質量的適宜指標.但本研究在實驗過程中發(fā)現(xiàn)白術內(nèi)酯Ⅱ極不穩(wěn)定，其穩(wěn)定性和精密度均不能達到要求，故只對白術飲片中白術內(nèi)酯I、白術內(nèi)酯III、蒼術酮成分進行一測多評法的研究，之所以選擇白術內(nèi)酯III作為內(nèi)參物是由于它在白術飲片中的含量高于白術內(nèi)酯I，而蒼術酮對照品難以制備且價格昂貴，故本實驗選擇性質穩(wěn)定且價格適中的白術內(nèi)酯III作為內(nèi)參物.本次實驗中使用的蒼術酮對照品純度為85%，在實驗過程中的含量按100%折算.

同時，本研究還對白術飲片一測多評法的供試品制備條件進行了考察：溶媒(甲醇、95%乙醇、水)；溶媒倍數(shù)(20、40、80倍)；超聲時間(10、20、30 min)，以峰面積加權評分法確定了“2.1.3”項下的供試液制備方法.對不同的色譜條件進行考察后確定了“2.1.1”項下的色譜條件，在該色譜條件下，各待測成分分離度良好，達到基線分離.

此外，本研究以白術內(nèi)酯III為內(nèi)參物，建立白術內(nèi)酯I、蒼術酮相對白術內(nèi)酯III的相對校正因子，先得到白術飲片中白術內(nèi)酯III的含量(外標法)，進而計算得到白術內(nèi)酯I、蒼術酮的含量(相對校正因子).通過對13批白術飲片的含量測定發(fā)現(xiàn)，一測多評法和外標法兩法所得數(shù)值間RSD<5%.白術飲片一測多評法的準確度、重復性、穩(wěn)定性及精密度均較好.相對保留值較相對時間差能更好地定位色譜峰，RSD<2%.另外，為了確定白術飲片一測多評法的適應性，分別考察了2種高效色譜儀(P230II型、Ichrom 5100型)、2種型號色譜柱(依利特Supersil C18、Global GS-120-5-C18-AP)、3種柱溫(30、35、40 ℃)、3種流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)對相對校正因子的影響.但由于實驗條件的限制，沒有采用更多型號或類別的液相色譜儀和色譜柱進行驗證，耐用性和系統(tǒng)適應性有待進一步研究.實驗結果表明，本研究建立的一測多評法可同時簡便快速準確地測定白術飲片中主要及有效成分(蒼術酮、白術內(nèi)酯I、白術內(nèi)酯III)的含量，能用于白術飲片含量的控制.