柄藍(lán)狀菌原生質(zhì)體的制備與再生條件優(yōu)化

張薈蓉，周志義，耿安利

1.武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.武漢工程大學(xué)化工與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430205；3.新加坡義安理工學(xué)院，新加坡 999002

近年來，絲狀真菌在工業(yè)酶方面的研究得到了廣泛應(yīng)用。柄藍(lán)狀菌EMM是絲狀真菌中一株經(jīng)過誘變的高產(chǎn)纖維素酶菌株，是由本實(shí)驗(yàn)室自主分離得到，其纖維素與半纖維素的產(chǎn)量已經(jīng)可以達(dá)到工業(yè)水平［1］。為了更進(jìn)一步提高纖維素酶的產(chǎn)量，從分子水平上分析菌株的特性，轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立成為其研究的第一步［2］。相比于其他受體的轉(zhuǎn)化體系，絲狀真菌因?yàn)榇嬖诩?xì)胞壁，會導(dǎo)致在轉(zhuǎn)化時外源基因很難進(jìn)入［3］。針對絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方法主要有PEG/CaCl2原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化［4-5］，電擊轉(zhuǎn)化［6-7］，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化［8-9］，基因槍轉(zhuǎn)化［10］，限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)化［11］，其中PEG/CaCl2原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是現(xiàn)在絲狀真菌使用最多的轉(zhuǎn)化方法［12］。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法雖然受體形式多樣，轉(zhuǎn)化效率高，但其在轉(zhuǎn)化過程中會在轉(zhuǎn)化體系中引入外源片段［13］，并且操作復(fù)雜，周期長，轉(zhuǎn)過過程容易受影響［14］。PEG/CaCl2原生質(zhì)體方法操作簡單，轉(zhuǎn)化效率高，整合度高，并且容易得到多拷貝而成為常用的轉(zhuǎn)化方法［15］。常見的真菌黑曲霉［16］、紅曲霉［17］，Trichoderma viride［18］和絲狀真菌AL18［19］等均采用原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法，已經(jīng)建立了良好的轉(zhuǎn)化體系。PEG/CaCl2原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中，足夠數(shù)量且再生能力強(qiáng)的原生質(zhì)體的制備是最為重要的部分［20-21］。因不同真菌的細(xì)胞壁構(gòu)造不同，裂解收集原生質(zhì)體的方式也會不同，因此不同菌種中制備原生質(zhì)體的方法也需要不斷地探索優(yōu)化。另外，轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中原生質(zhì)體高效的再生能力也是其成功的核心，再生率的提升表明陽性轉(zhuǎn)化子獲得幾率的提升，因此會提高轉(zhuǎn)化效率。本課題將分別從材料的選擇，真菌菌齡，滲透壓穩(wěn)定劑種類，裂解酶酶種類，裂解酶的濃度，酶解時間及原生質(zhì)體再生方式，對柄藍(lán)狀菌EMM原生質(zhì)的制備與再生進(jìn)行探索和優(yōu)化，為后續(xù)絲狀真菌EMM在分子水平方面的研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)［22］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材 料

1.1.1 菌株 柄藍(lán)狀菌（Talaromyces stipitatus）EMM是由分離于新加坡的野生菌OPC4-1誘變所得，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶和試劑 裂解酶（Lysing enzymes from Trichoderma harzianum，Sigma公 司）；蝸 牛 酶（Snailase，上海生物工程有限公司）。溶液1（10 mmol/L Na2HPO4+1.2 mol/L MgSO4，pH 5.8）；溶液 2（0.6 mol/L Sorbitol+0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.0）；溶液 3（1 mol/L Sorbitol+10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）；溶 液 4（1 mol/L Sorbitol+10 mmol/L Tris-HCl+10 mmol/L CaCl2，pH 7.5）；溶液 5（質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%PEG6000+50 mmol/L CaCl2+10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基（Merck公司）；Seed Medium（10 g/L glucose，1 ml/L Tween 80，F(xiàn)ermenta?tion Medium）；PDB培養(yǎng)基（Merck公司）；Spore Medium（30 g/L Solka-floc，Wheat Bran 40 g/L，Agar 15 g/L，F(xiàn)ermentation Medium）。

1.2 方 法

1.2.1 孢子的收集 將一定量的EMM孢子，接種于孢子培養(yǎng)基PDA平板上，30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，等長出足夠量的孢子后，用0.9%NaCl溶液將孢子輕輕洗脫，用雙層的孔徑30 μm尼龍布過濾除去菌絲和培養(yǎng)基等雜質(zhì)，制備成一定濃度的孢子懸液。

1.2.2 菌絲的收集 從PDA平板上挑取一定量的EMM菌絲，接種到250 mL搖瓶中，搖瓶里含有50 mL種子培養(yǎng)基，將搖瓶放置在28℃培養(yǎng)箱中，120 r/min培養(yǎng)2 d，待長出適量的菌絲后，用雙層的孔徑30 μm尼龍布過濾收集菌絲，并用雙蒸水洗滌2次，以備使用。

1.2.3 酶解液的配制 緩沖液分別用1.2 mol/L MgSO4，0.8 mol/L NaCl，0.8 mol/L蔗糖（Sucrose），以1 mol/L山梨醇（Sorbitol），準(zhǔn)備不同濃度的裂解酶（Lysing enzymes from Trichoderma harzianum）、蝸牛酶（Snailase）（表1），0.2 μm濾膜除菌以備使用，酶解液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 復(fù)合酶的不同配比組合Tab.1 Different enzyme ratios of compound enzymes

1.2.4 原生質(zhì)體的收集 制備復(fù)合酶酶解液，分別配置成不同的濃度，平板上收集0.2 g孢子和菌絲，8 000 r/min離心，用20 mL溶液1洗滌2次，沉淀用20 mL復(fù)合酶酶解液于50 mL的搖瓶中，置于30℃的水浴鍋中以80 r/min的速度震蕩裂解，分別培養(yǎng)1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，用雙層的孔徑30 μm尼龍布過濾收集原生質(zhì)體。調(diào)節(jié)離心機(jī)溫度為4℃，5 000 r/min離心10 min，用20 mL溶液2洗滌2次，在相同的離心的條件下，再用20 mL溶液3洗滌2次，最后在冰浴條件下加入適量的溶液4懸浮，通過血球計(jì)數(shù)器計(jì)算原生質(zhì)體的濃度。

1.2.5 原生質(zhì)體再生條件的探索 將收集到的原生質(zhì)體用溶液4調(diào)節(jié)至濃度為1×103/mL，用兩種方式進(jìn)行再生培養(yǎng)：方式一為在菌絲生長培養(yǎng)基PDA平板上直接鋪板；方式二為在液體再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，然后再與PDA混合涂板，平板均置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，觀察平板上再生菌落的數(shù)目；對照組用無菌水代替溶液4調(diào)節(jié)原生質(zhì)體至相同濃度，以相同的培養(yǎng)條件進(jìn)行再生培養(yǎng)，除去孢子和殘留菌絲造成的誤差。原生質(zhì)體再生率（%）=［（再生菌落數(shù)量-對照菌落數(shù)量）/原生質(zhì)體數(shù)量］×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 原生質(zhì)體的形態(tài)

細(xì)胞在裂解酶的作用下，首先是細(xì)胞壁被酶解破碎，然后原生質(zhì)體從菌絲的尖端開始析出，再慢慢釋放。通常狀態(tài)下原生質(zhì)體會呈透明圓形。在普通光學(xué)顯微鏡下，分別觀察酶解前的EMM菌絲和酶解過濾后收集的原生質(zhì)體的形態(tài)并拍照，結(jié)果如圖1。

圖1 光學(xué)顯微鏡下的EMM：（a）菌絲，（b）原生質(zhì)體Fig.1 Observation EMM with microscope：（a）mycelium，（b）protoplasts

2.2 原生質(zhì)體材料選擇對其制備與再生的影響

選擇孢子（Spore）和菌絲（Mycelium）作為原生質(zhì)體制備材料，比較它們對原生質(zhì)體制備與再生的影響。如圖2（a）所示，菌絲的尖端更容易產(chǎn)生原生質(zhì)體，選擇用EMM菌絲作為原生質(zhì)體制備材料時原生質(zhì)體的濃度最高（Protoplast concentration 6.23×108/mL）且再生率最高（Regeneration rate 15.6%），因此將EMM菌絲作為其制備材料。

2.3 菌齡及滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體制備與再生的影響

以不同真菌菌齡（Fungal age）12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的菌絲作為原生質(zhì)體制備材料，以不 同 的 滲 透 壓 1.2 mol/L MgSO4、0.8 mol/L NaCl、0.8 mol/L Sucrose、1 mol/L Sorbitol作為原生質(zhì)體制備時的滲透壓穩(wěn)定劑（Osmotic stabilizer），分別比較它們對原生質(zhì)體制備與再生的影響。結(jié)果如圖2（b）所示，細(xì)胞壁的成分隨著菌株的生長而發(fā)生了變化，導(dǎo)致酶解效率達(dá)到一定程度后開始下降，菌種年齡為48 h時原生質(zhì)體的數(shù)量最多（Protoplast concentration 7.74×108/mL），原生質(zhì)體的再生能力會隨菌種年齡改變，菌種年齡為60 h時原生質(zhì)體的再生率最高（Regeneration rate 16.8%），但生成的原生質(zhì)體的數(shù)量明顯偏低（Protoplast concentration 5.27×108/mL），綜合考慮原生質(zhì)體的制備材料選擇用48 h菌齡的EMM菌絲；滲透壓溶液的選擇主要考慮兩個因素，第一是能穩(wěn)定和保護(hù)原生質(zhì)體的生成，第二是能對酶的酶解效果有促進(jìn)作用，如圖2（c）所示，雖然1 mol/L Sorbitol作為滲透壓穩(wěn)定劑時原生質(zhì)體的再生率最高（Regeneration rate 16.3%），但生成原生質(zhì)體的數(shù)量偏少（Protoplast concentration 4.27×108/mL），而1.2 mol/L MgSO4作為原生質(zhì)體制備時的滲透壓穩(wěn)定劑（Osmotic stabilizer）時原生質(zhì)體的數(shù)量最多（Protoplast concentration 6.82×108/mL）且再生率也比較高，綜合考慮選擇1.2 mol/L MgSO4作為原生質(zhì)體制備時的滲透壓穩(wěn)定劑。

2.4 酶的種類配比和酶解時間對原生質(zhì)體制備與再生的影響

以不同酶的種類配比（Enzyme ratio）和酶解時間（Enzymolysis time）分別作為制備原生質(zhì)體時的酶解條件，比較兩種因素對原生質(zhì)體制備和再生的影響。選擇合適的酶解條件時需要考慮兩個因素：一是形成原生質(zhì)體的速度；二是原生質(zhì)體再生的效率。如圖 2（d）和 2（e）所示，酶的種類配比為B時，原生質(zhì)體的數(shù)量（Protoplast concentration 8.23×108/mL）和再生率（Regeneration rate 15.8%）最為合適，同時酶解時間達(dá)到3 h時原生質(zhì)體的數(shù)量則為最多（Protoplast concentration 8.52×108/mL）且再生率最高（Regeneration rate 15.2%）。綜合分析選擇酶的種類配比為B（50 mg/mL的裂解酶），酶解時間為3 h作為原生質(zhì)體的制備條件。

圖2 對EMM原生質(zhì)體生成量與再生率的影響：（a）制備材料，（b）菌種年齡，（c）滲透壓穩(wěn)定劑，（d）酶的種類配比，（e）酶解時間Fig.2 Effects on protoplasts production and regeneration rate of EMM：（a）preparation materials，（b）fungal age，（c）osmotic stabilize，（d）enzyme ratios，（e）enzymolysis time

2.5 不同再生方式對原生質(zhì)體再生的影響

方式一為在菌絲生長培養(yǎng)基PDA平板上直接鋪板（Direct plating）；方式二為在液體再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，然后再與PDA混合涂板（After hatch?ing），比較兩種方式對原生質(zhì)體再生率的影響。原生質(zhì)體若失去細(xì)胞壁的支撐與保護(hù)，就會變得易破碎和易被感染。如圖3所示，原生質(zhì)體先在液體再生培養(yǎng)基中孵育12 h恢復(fù)細(xì)胞壁，再與PDA培養(yǎng)基混合鋪板提高原生質(zhì)體的再生率，選擇該種方式作為原生質(zhì)體的再生條件，原生質(zhì)體的再生率最高（Regeneration rate 17.2%）。 圖4所示，圖4（a）和圖4（b）分別為方式一和方式二條件下原生質(zhì)體在PDA平板上的生長狀態(tài)，因此選擇方式一為原生質(zhì)體的再生條件。

圖3 原生質(zhì)體再生方式對EMM原生質(zhì)體再生率的影響Fig.3 Effects of regeneration methods of protoplasts on protoplasts regeneration rate of EMM

圖4 兩種不同的再生方式得到的原生質(zhì)體在PDA平板上的生長狀況：（a）直接涂板，（b）先培養(yǎng)后混合涂板Fig.4 Growth conditions of protoplasts on PDA plates：（a）directing plating，（b）after hatching

3 結(jié) 語

原生質(zhì)體的制備與再生是PEG/CaCl2介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化方法的基礎(chǔ)，原生質(zhì)體的數(shù)量與再生能力直接影響轉(zhuǎn)化效率。本文首次成功建立了柄藍(lán)狀菌EMM以PEG/CaCl2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系，從材料選擇，真菌菌齡，滲透壓穩(wěn)定劑種類，裂解酶種類，裂解酶濃度，酶解時間及原生質(zhì)體的再生方式，對絲狀真菌柄藍(lán)狀菌EMM的原生質(zhì)制備與再生條件進(jìn)行探索優(yōu)化。獲得最佳的原生質(zhì)的制備與再生條件：制備材料為48 h的菌絲，滲透壓穩(wěn)定劑為1 mol/L MgSO4，裂解酶濃度為50 mg/mL，酶解溫度為30℃，酶解時間為3 h，再生方式為先孵化培養(yǎng)再混合倒板。在此條件下原生質(zhì)體的釋放量高達(dá)8.73×108/mL，再生率高達(dá)17.7%。本實(shí)驗(yàn)所獲得的原生質(zhì)體的釋放量和再生率均達(dá)到了較高的水平，絲狀真菌AL18［18］的原生質(zhì)體制備率和再生率僅為 1.42×107/mL 和 3.2%；Trichoderma viride［19］的原生質(zhì)體制備率和再生率為4.7×107/mL和14.5%。相比較而言，本實(shí)驗(yàn)所建立的最適條件已經(jīng)完全達(dá)到了后續(xù)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的要求，為柄藍(lán)狀菌的分子水平研究奠定了良好的基礎(chǔ)。