核-殼型松香基磁性聚合物固定化脂肪酶的制備及性能

黎克純，雷福厚，2，盧建芳，2*，周菊英，2，許海棠，2，趙彥芝，2

（1.廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530006；2.廣西民族大學(xué) 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006）

脂肪酶作為一種特殊的生物催化劑，既可以促進(jìn)油脂的水解，又可以在一定的條件下加速油脂的合成，發(fā)生酯交換反應(yīng)[1-2]。鑒于以上特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、工業(yè)等領(lǐng)域。但游離酶在使用過(guò)程中局限性較大（如成本高、難回收、易失活、重復(fù)使用率低），使酶的應(yīng)用提出較大挑戰(zhàn)，固定化酶技術(shù)的提出，提高了酶的催化性能、操作穩(wěn)定性和重復(fù)利用率，并降低了生產(chǎn)成本，為酶提供了廣闊的應(yīng)用前景[3-5]。

磁性復(fù)合材料既具有功能化基團(tuán)，又具有良好的磁導(dǎo)向性，可以結(jié)合多種生物分子，且通過(guò)外加磁場(chǎng)快速進(jìn)行分離和回收。因此被廣泛應(yīng)用制備固定化脂肪酶領(lǐng)域[6-9]。

本研究以天然產(chǎn)物松香的衍生物為交聯(lián)劑，采用共沉淀法及懸浮聚合法制備出具有磁性的核-殼結(jié)構(gòu)的球狀聚合物，用化學(xué)交聯(lián)法固定脂肪酶。優(yōu)化了載體的制備及酶固定化條件，表征了核-殼型松香基磁性微球的結(jié)構(gòu)和考察了酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬來(lái)松香乙二醇丙烯酸酯：本實(shí)驗(yàn)室自制；甲基丙烯酸、丙烯酸、戊二醛、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、十二水合磷酸二鈉、磷酸二氫鉀等（均為分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠；脂肪酶（生物試劑），聚乙烯醇、橄欖油、二氯亞砜（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；所有溶液均使用高純水配制。

1.2 儀器與設(shè)備

SYC-15超級(jí)恒溫水浴鍋：南京桑力電子設(shè)備廠；Scientz-10N冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；ZJ-2B磁天平：南京多助科技發(fā)展有限公司；ASAO2010微孔分析儀：美國(guó)麥克micromertics公司；SUPRA55Sapphire場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡：德國(guó)卡爾蔡司（carlZEISS）公司；D8Advance型x射線衍射儀：德國(guó)布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 具有菲環(huán)結(jié)構(gòu)的高分子磁性微球的制備

取甲基丙烯酸4.2 g、丙烯酸1.8 g和馬來(lái)松香丙烯酸乙二醇酯20.0 g，溶于50 mL乙酸乙酯后再加入過(guò)氧化二苯甲酰0.06g，超聲20min后再加入FeCl3·6H2O3.2g、FeCl2·4H2O 1.4 g及蒸餾水100 mL，繼續(xù)超聲30 min，然后400 r/min攪拌，緩慢加熱至80℃，迅速加入25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的氨水再保溫6 h。通過(guò)外加磁場(chǎng)分離出磁性微球，并用無(wú)水乙醇和去離子水反復(fù)洗滌。

取上述固體5 g加入5 mL吡啶中，冰浴條件下緩慢滴加15mL二氯亞砜，反應(yīng)4h后減壓抽濾。再向其中加入溶有5 mL乙二胺的10 mL 1.4-二氧六環(huán)的溶液。常溫條件下，磁力攪拌反應(yīng)2 h，在外加磁場(chǎng)的作用下固液分離并用蒸餾水反復(fù)洗滌。

1.3.2 松香基載體性能與結(jié)構(gòu)的測(cè)試

傅里葉變換紅外光譜學(xué)（Fouriertransforminfrared，F(xiàn)T-IR）分析：樣品與標(biāo)準(zhǔn)溴化鉀固體按質(zhì)量比為1∶200進(jìn)行混合，壓片后進(jìn)行測(cè)試，分析樣品所含官能團(tuán)。

孔徑分析：采用微孔分析儀，低溫條件下氮?dú)馕?脫附，測(cè)試磁性微球的比表面積、孔體積及平均孔徑。

X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）分析：采用x射線衍射儀對(duì)樣品進(jìn)行物相分析。使用Cu-Kα作為輻射源，采用步進(jìn)掃描，掃描范圍2θ為10～80°，步長(zhǎng)為0.013，掃描速率為5°/min。

掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）分析：采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，觀測(cè)磁性微球的外部及內(nèi)部的形貌。

磁化率：按照參考文獻(xiàn)[10]測(cè)定磁化率：采用古埃及磁天平測(cè)定松香基磁性微球在磁場(chǎng)強(qiáng)度為400 mT的磁化率。以莫爾鹽為基準(zhǔn)物質(zhì)，計(jì)算公式為：

式中：M樣、M標(biāo)分別為待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量，g；ΔM樣、ΔM標(biāo)分別為待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品施加外加磁場(chǎng)的質(zhì)量差。M標(biāo)=37.3 mg，M樣=35.6 mg。

1.3.3 固定化脂肪酶的制備方法

稱取1.0 g脂肪酶粉末，放入50 mL的磷酸鹽緩沖溶液（pH7.5）中，加入磁性松香基微球（載體與酶的質(zhì)量比從1∶0.5～1∶5.0），磁力攪拌條件下，加入體積分?jǐn)?shù)50%的戊二醛（加入量為總體積的0.1%～2.7%），冰浴條件下，反應(yīng)0.5～4 h，在外加磁場(chǎng)的作用下固液分離并用蒸餾水反復(fù)洗滌，將制得的固定化酶冷凍干燥。

1.3.4 酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

最適溫度和pH：分別將固定化酶和游離酶置于20～70℃水浴中和pH值為5.8～8.0緩沖溶液中按照1.3.5進(jìn)行酶活檢測(cè)。

熱穩(wěn)定性：分別將固定化酶和游離酶置于50℃水浴中，每隔30 min測(cè)其活力，考察載體固定化技術(shù)能否提高酶的耐熱性能。

儲(chǔ)存穩(wěn)定性：將固定化酶與游離酶同時(shí)放在4℃的冰箱保存，每隔一段時(shí)間測(cè)定一次活力，以最高的酶活為100%。

操作穩(wěn)定性：將固定化酶置于45℃，pH 7.0的底物中，按1.3.5進(jìn)行酶活測(cè)定。每次催化完成后，回收固定化酶，用于下一次反應(yīng)：把第一次使用時(shí)酶活定義為100%?？疾旃潭ɑ冈诖呋磻?yīng)中的重復(fù)使用性。

1.3.5 測(cè)定方法

按照參考文獻(xiàn)[11]測(cè)定酶的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 核-殼型松香基磁性球狀聚合物的制備

各反應(yīng)條件對(duì)磁含量的影響見(jiàn)圖1。

由圖1a可知，形成聚合物的磁含量隨著反應(yīng)溫度的升高呈先增大后減小的趨勢(shì)，在反應(yīng)溫度為75℃時(shí)，磁含量最高為20.35%?？赡苁且?yàn)榇朔磻?yīng)為自由基聚合，引發(fā)劑受熱裂解產(chǎn)生自由基，溫度越高產(chǎn)生的自由基越多。當(dāng)自由基少時(shí)，不易在磁核周圍發(fā)生聚合，難形成核-殼型磁性聚合物；當(dāng)自由基多時(shí)，F(xiàn)e3O4周圍的自由基不斷發(fā)生碰撞，易形成大顆粒，含磁量較少。因此選擇反應(yīng)溫度為75℃為宜。

由圖1b可知，形成聚合物的磁含量隨引發(fā)劑用量的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)引發(fā)劑用量為單體總質(zhì)量的1%時(shí)，形成的聚合物磁含量最高為21.52%?？赡苁且?yàn)殡S著引發(fā)劑用量增加，溶液中的自由基濃度逐漸增加，F(xiàn)e3O4經(jīng)歷了從不易被包覆，到易于被分子質(zhì)量較低的高分子包覆，最后到分子質(zhì)量較高的高分子包覆的過(guò)程。因此選擇引發(fā)劑用量為1%為宜。

由圖1c可知，隨著水油比的增加呈先增大后減少的趨勢(shì)，當(dāng)水油體積比為2∶1時(shí)，形成的聚合物磁含量最高為21.87%?？赡苁且?yàn)橐l(fā)劑（過(guò)氧化二苯甲酰）屬于油溶性引發(fā)劑，在不斷的攪拌下，含有引發(fā)劑的油滴分散在水中，形成水包油。引發(fā)劑裂解產(chǎn)生的自由基，與油水界面的單體發(fā)生自由基傳遞，從而形成聚合物。隨著水量的增加，油滴可以均勻的分散在水中，與水中單體及Fe3O4的接觸機(jī)會(huì)增加，易形成含磁量高的聚合物。當(dāng)繼續(xù)加大水量，相當(dāng)于稀釋引發(fā)劑、單體及Fe3O4的濃度，因此合成的聚合物磁量逐漸減少。因此選擇水油體積比為2∶1為宜。

由圖1d可知，形成聚合物的磁含量隨著轉(zhuǎn)速的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)轉(zhuǎn)速為450 r/min時(shí)，聚合物的磁含量最高為22.23%?？赡苁且?yàn)楫?dāng)加大攪拌速度時(shí)，相當(dāng)于加快自由基相對(duì)運(yùn)動(dòng)，增加Fe3O4面自由基碰撞聚合的機(jī)會(huì)，易合成含磁量較高的高分子。當(dāng)攪拌速度繼續(xù)增大，剪切力逐漸增強(qiáng)，含有表引發(fā)劑的液體形成更多更小的小液滴，分散在溶液中，能產(chǎn)生更多的自由基，自由基之間更易于聚合，可能形成的聚合物未包覆上Fe3O4（只有在Fe3O4表面的自由基發(fā)生聚合，才易得到磁性高分子）含磁量減小。因此選擇轉(zhuǎn)速為450 r/min為宜。

由圖1e可知，形成聚合物的磁含量隨著聚合反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)聚合反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)，最佳磁含量為23.32%?？赡苁且?yàn)檎麄€(gè)反應(yīng)的過(guò)程就是自由基在Fe3O4表面不斷聚合，把Fe3O4包覆在高分子內(nèi)。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，不斷有自由基碰撞包覆在Fe3O4的外層，形成較大的顆粒，F(xiàn)e3O4外層被分子量較高的松香基高分子包覆，磁含量相對(duì)減小。因此選擇聚合反應(yīng)時(shí)間4h為宜。

圖1 反應(yīng)條件對(duì)磁含量的影響Fig.1 Effect of reaction condition on magnetic content

2.2 松香基載體性能與結(jié)構(gòu)

2.2.1 FT-IR分析

圖2 松香基磁性微球的傅里葉變換紅外譜圖Fig.2 FTIR spectra of rosinyl magnetic microspheres

由圖2可知，580 cm-1為Fe-O的伸縮振動(dòng)，說(shuō)明Fe3O4包裹在松香基微球里，形成核-殼結(jié)構(gòu)[12]；1 724 cm-1出現(xiàn)了吸收峰為酰胺基的C=O的伸縮振動(dòng)，3 374 cm-1為N-H的伸縮振動(dòng)，1 644 cm-1、1 448 cm-1為C-N伸縮振動(dòng)，以上均表明該核-殼型松香基磁性微球含有-CO-NH-基團(tuán)[13]；1 167 cm-1為C-N伸縮振動(dòng)，1 552 cm-1為N-H彎曲振動(dòng)，說(shuō)明該改性核-殼型松香基磁性微球含有-NH2基團(tuán)[14]。

2.2.2 孔結(jié)構(gòu)分析

采用靜態(tài)氮?dú)馕椒ㄔ诘蜏貤l件下測(cè)定磁性微球（2.5～4 mm）的比表面積、孔體積及平均孔徑，分別為23.36 m2/g、0.427 cm3/g和18.574 nm。

2.2.3 XRD分析

具有菲環(huán)骨架的高分子磁性微球的XRD圖譜如3圖所示。

由圖3可知，2θ=30.18、35.49、43.11、56.90、62.58處的衍射峰，分別屬于Fe3O4的（220）（311）（400）（511）（440）晶面的衍射，與Fe3O4的標(biāo)準(zhǔn)卡（JCPDS NO.74-0748）結(jié)果基本相符[15]。

圖3 松香磁性微球的XRD圖譜Fig.3 XRD spectra of the rosinyl magnetic microspheres

2.2.4 SEM分析

圖4 松香基磁性微球的電鏡圖Fig.4 SEM images of the rosinyl magnetic microspheres

由圖4a可知，磁性微球表面有大量大小不一的孔洞，脂肪酶和戊二醛可以通過(guò)孔洞進(jìn)入，與微球內(nèi)部的官能團(tuán)結(jié)合。由圖4b可知，微球剖面圖內(nèi)部有大量空腔，比較蓬松，增大了微球內(nèi)部的表面積，有利于固定在微球孔道內(nèi)部的酶與底物接觸發(fā)生反應(yīng)。

2.2.5 磁化率測(cè)定[10]

表1 松香基磁性微球磁化結(jié)果Table 1 Magnetic structure of rosinyl magnetic microspheres

由表1可知，產(chǎn)品磁化率為5.375×10-4cm3/g，在10-5～10-3之間，說(shuō)明產(chǎn)品具有順磁性[16]。

2.3 優(yōu)化固定條件

本固定化方法是利用戊二醛兩端的-CHO基與載體和脂肪酶的-NH2基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，將酶固定在載體上。交聯(lián)條件對(duì)固定化酶活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 交聯(lián)條件對(duì)固定化酶活力的影響Fig.5 Effect of crosslinking conditions on activity of immobilizedlipase

由圖5a可知，隨著交聯(lián)劑（戊二醛）濃度的增加，酶活回收率呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)戊二醛濃度為1.5%時(shí)，所得固定化酶活性最高?？赡苁且?yàn)榻宦?lián)劑濃度較低時(shí)，游離酶分子不能完全固定在載體上，制備的固定化酶活力不高。但是隨著交聯(lián)劑濃度的增大，過(guò)多的戊二醛分子與固定化酶的酶分子活性中心發(fā)生交聯(lián)，從而降低酶的活力[17]。

由圖5b可知，隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活回收率呈先增大后減小的趨勢(shì)。交聯(lián)時(shí)間為1 h時(shí)酶活回收率達(dá)最大值。當(dāng)固定化時(shí)間太短，酶沒(méi)有完全結(jié)合在載體上，固定化酶活力小。戊二醛即是一種交聯(lián)劑又是一種變性劑，長(zhǎng)時(shí)間與酶接觸，戊二醛有更多機(jī)會(huì)破壞起催化作用的酶的活性中心，使部分酶失去活性[18]。同時(shí)，當(dāng)過(guò)多的酶擁擠在載體的孔道內(nèi)，阻礙了與底物的接觸，導(dǎo)致固定化酶活性低。

由圖5c可知，隨著酶與載體質(zhì)量比的增加，酶活回收率呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)酶與載體的質(zhì)量比為2∶1時(shí)，酶活回收率最大為86.17%。當(dāng)有過(guò)多的酶固定在載體表面或是孔道內(nèi)部，由于酶分子間的空間位阻的關(guān)系，導(dǎo)致有部分酶的活性中心與底物不能充分接觸。酶的有效利用率低，不經(jīng)濟(jì)環(huán)保。

2.4 酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適溫度和pH

圖6 固定化酶和游離酶的最適溫度（a）和pH（b）Fig.6 Optimum temperature(a)and pH(b)of immobilized lipase and free lipase

由圖6可知，相比游離脂肪酶，固定化酶的最適溫度提高了約5℃。可能是載體的剛性結(jié)構(gòu)保護(hù)了酶分子結(jié)構(gòu)，故固定化酶的耐熱性提高[19]。與游離酶相比，固定酶的最適pH值向堿性方向移動(dòng)0.5個(gè)單位?？赡苁怯捎诠潭ɑ傅陌被绊?，使固定化酶周圍產(chǎn)生濃度梯度導(dǎo)致固定化酶的最適pH值發(fā)生移動(dòng)[20]。

2.4.2 熱穩(wěn)定性

圖7 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of immobilized lipase and free lipase

酶分子固定在具有剛性結(jié)構(gòu)的磁性松香基載體上，有利于保護(hù)酶分子的三維結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)酶的剛性，減少其受外界條件的影響。游離酶在50℃保溫，酶活力下降明顯，240 min后，殘余活力僅為最初的7.15%。而固定酶在50℃保溫，其活力下降緩慢，240min后，活力仍為原來(lái)的72.56%，可見(jiàn)固定酶具有更好的熱穩(wěn)定性。

2.4.3 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

圖8 固定化酶和游離酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of immobilized lipase and free lipase

由圖8可知，游離酶的活性下降很快，而固定化酶存儲(chǔ)3個(gè)月，活性仍保持在85%左右，說(shuō)明固定化后脂肪酶的存放能力明顯提高?？赡茉蚴牵海?）用交聯(lián)劑（戊二醛）將脂肪酶分子固定在載體上，可防止酶分子伸展變性[21]；（2）載體的剛性結(jié)構(gòu)保護(hù)了酶分子的三維結(jié)構(gòu)，減少外界不利因素對(duì)酶結(jié)構(gòu)的破壞。

2.4.4 固定化酶的穩(wěn)定性

圖9 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.9 Operation stability of immobilized lipase

以核-殼型松香基磁性微球?yàn)檩d體的固定化酶重要的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)就是可利用外加磁場(chǎng)快速將固定化酶從反應(yīng)媒介中分離回收，再利用?？梢院?jiǎn)化后續(xù)操作工藝，降低損耗費(fèi)用，減少環(huán)境污染。由圖9可知，連續(xù)循環(huán)7個(gè)批次，其相對(duì)酶活力仍保持73.52%。

3 結(jié)論

在水油體積比為2∶1，加入單體總質(zhì)量1%的引發(fā)劑（過(guò)氧化二苯甲酰），轉(zhuǎn)速450 r/min，反應(yīng)溫度為75℃時(shí)，聚合4 h，制備出核-殼型松香基磁性微球。

核-殼型松香基磁性微球?yàn)檩d體，交聯(lián)法制備固定化脂肪酶。50%的戊二醛（交聯(lián)劑）用量為1.5%（總體積）；交聯(lián)4 h；酶與載體的質(zhì)量比為2∶1制得的固定化酶最大酶活回收率為86.17%。

固定化脂肪酶的最適溫度及pH值分別為45℃、7.0；比游離酶提高了約5℃，向堿性方向移動(dòng)0.5個(gè)單位；50℃保溫4 h，固定化酶酶活力保留72.56%，而游離酶只有7.15%，說(shuō)明酶固定在松香基磁性載體上熱穩(wěn)定性提高；儲(chǔ)存穩(wěn)定性及操作穩(wěn)定性均有所提高。

可利用磁性快速?gòu)姆磻?yīng)媒介中回收，再利用，可以簡(jiǎn)化后續(xù)操作工藝，降低損耗費(fèi)用，減少環(huán)境污染。此方法可以作為一種通用方法，開(kāi)發(fā)各種基于多孔松香基磁性載體的固定化酶。