全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化產(chǎn)ACE抑制肽羊乳發(fā)酵工藝及其冷藏研究

陳 合，李儀琳*，張博文，王 媛

（陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

高血壓已成為當(dāng)今危害人類(lèi)健康的高發(fā)病癥，在我國(guó)高血壓患病率仍保持增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]，且近幾年的高血壓患病人群趨于低齡化。目前，傳統(tǒng)的降壓藥雖具有抗高血壓作用，但同時(shí)也具有一些副作用[2]。因此，人們逐漸趨向于選擇安全性高，可靠的生物抑制肽[3]，而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensinconveningenzyme，ACE）抑制肽則是一個(gè)成功的商業(yè)化應(yīng)用案例[4]。ACE是一種與膜結(jié)合的含Zn2+和Cl-的羧肽酶，主要存在于哺乳動(dòng)物的血漿及組織中。在腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）中，血管緊張素原在腎素的作用下形成無(wú)活性的血管緊張素Ⅰ，血管緊張素Ⅰ在ACE的轉(zhuǎn)化作用下形成可促進(jìn)血管收縮并導(dǎo)致血壓升高的血管緊張素Ⅱ；在激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS）中，激肽原在激肽釋放酶的作用下形成可使血管舒張的舒緩激肽，舒緩激肽可促進(jìn)血管舒張，進(jìn)而使得血壓降低。而ACE可使舒緩激肽失活，從而抑制其降壓作用[5-8]。因此，ACE活性的抑制可有效避免高血壓的發(fā)生。而ACE抑制肽（降壓肽）能有效抑制ACE活性，進(jìn)而抑制RAS中的血壓升高效應(yīng)和促進(jìn)KKS中的血壓降低效應(yīng)，最終起到降低高血壓的作用[9-10]。并且ACE抑制肽和其他降壓藥物相比，具有安全性高、無(wú)副作用、分子質(zhì)量低、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)[11]。

ACE抑制肽的制備方法有直接提取、化學(xué)合成、微生物發(fā)酵和酶解法。產(chǎn)生ACE抑制肽的主要方法是乳制品的微生物發(fā)酵。近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)多種益生菌用于發(fā)酵ACE抑制肽。GOBBETTI M等[12]使用保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）SS1和乳脂乳桿菌（L.lactissubsp.cremoris）FT4混合制備ACE抑制肽；NIELSEN M S等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，兩株瑞士乳桿菌（L.helveticus）的發(fā)酵產(chǎn)物具有很強(qiáng)的ACE抑制活性，當(dāng)pH值從4.6降至4.3時(shí)，ACE抑制活性增加，并且冷藏可以顯著增加ACE抑制活性。

課題組在前期篩選出一株在發(fā)酵羊乳中產(chǎn)ACE抑制肽能力強(qiáng)的保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）LB6基礎(chǔ)上[15]，本研究以山羊乳為原料，產(chǎn)ACE抑制肽菌株保加利亞乳桿菌LB6和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）ST為發(fā)酵菌株，采用全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其在發(fā)酵羊乳中產(chǎn)ACE抑制肽的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并研究冷藏對(duì)發(fā)酵羊乳理化性質(zhì)及質(zhì)構(gòu)的影響，以提高發(fā)酵羊乳中ACE抑制肽的含量，為后續(xù)開(kāi)發(fā)含降壓肽的酸羊乳提供技術(shù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）LB6、嗜熱乳鏈球菌（S.thermophilus）ST：陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院。

1.1.2 試劑

全脂羊奶粉：陜西紅星乳業(yè)有限公司；酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)公司；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）（0.1U/mL）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）：美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基：青島希望生物科技有限公司；復(fù)水后的肉湯121℃滅菌15 min，冷卻后用于培養(yǎng)益生菌。

1.2 儀器與設(shè)備

YX-280D型手提式壓力蒸汽滅菌鍋：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；DH5000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-3C型酸度計(jì)：上海精科儀器有限公司；MDF-382E型超低溫冰箱：日本SANYO公司；TA.XT型物性測(cè)試儀：英國(guó)Stable Micro System公司；UV-5300PC型紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；Q2-901型旋渦混合儀：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；TG16A-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FD-1D-50型真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將保加利亞乳桿菌LB6的凍干菌粉接種至MRS培養(yǎng)基中，嗜熱乳鏈球菌ST的凍干菌粉接種至M17培養(yǎng)基中[16]，于37℃條件下24h培養(yǎng)活化3代，使種子液中菌體濃度均為1×1011CFU/mL，備用。

1.3.2 發(fā)酵乳的制備

在無(wú)菌操作條件下，按5%（V/V）的接種量將活化后的保加利亞乳桿菌LB6和嗜熱鏈乳球菌ST接種至固形物含量為14%的無(wú)菌復(fù)原全脂羊乳中，37℃培養(yǎng)12 h至凝乳，并保存于冰箱4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 羊乳發(fā)酵條件優(yōu)化全因子試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of full factorial experiments for optimization of goat milk fermentation conditions

1.3.4 冷藏對(duì)發(fā)酵羊乳理化性質(zhì)及質(zhì)構(gòu)的影響

采用最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)制備發(fā)酵羊乳，同批次制作樣品6份，于4℃冷藏，分別于0d（即發(fā)酵結(jié)束時(shí)）、3d、7d、14d、21 d和28 d時(shí)隨機(jī)取樣，測(cè)定其pH值、酸度、活菌數(shù)、ACE抑制率和質(zhì)構(gòu)的變化情況，并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，重復(fù)3次測(cè)量。

1.3.5 測(cè)定方法

ACE抑制率的測(cè)定：采用文獻(xiàn)[12-13]的方法測(cè)定。

活菌數(shù)的測(cè)定：取已活化的益生菌ST和LB6按5%（V/V）的接種量接種至濃度為14%的復(fù)原全脂羊乳中，于37℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣測(cè)定OD600nm值。

酸度的測(cè)定：采用氫氧化鈉滴定法[17]，以吉爾涅爾度（°T）表示。

pH值的測(cè)定：采用pHs-3c酸度計(jì)在室溫條件下直接測(cè)定。

感官評(píng)價(jià)：由5位及以上感官正常人員經(jīng)培訓(xùn)后品嘗，描述產(chǎn)品的表層外觀、組織狀態(tài)、口感、滋氣味、乳清析出等感官性狀。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)文獻(xiàn)[18]，滿(mǎn)分為10分。

斷路器垂直連桿與連桿軸套密封件之間存在機(jī)械磨損，是造成斷路器合閘時(shí)間、合閘不同期時(shí)間嚴(yán)重超標(biāo)和合閘速度偏低的直接原因。而造成斷路器垂直連桿與軸套密封件磨損的根本原因可能存在以下3個(gè)方面：

質(zhì)構(gòu)分析[19-21]：試驗(yàn)選用TA.XT型物性測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)定，A/BE探頭的壓力盤(pán)直徑為40 mm。測(cè)定參數(shù)：測(cè)前運(yùn)行速度與測(cè)試速度為1.0 mm/s、測(cè)后速度為10.0 mm/s；測(cè)試深度30.0 mm；感應(yīng)力：Auto-1.0 g；記錄速率：400 pps。每種樣品重復(fù)測(cè)定3次。測(cè)定的指標(biāo)有：硬度、稠度、凝聚性和黏度。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

羊乳生產(chǎn)條件的優(yōu)化采用JMP10Pro（SASJMPStatistical10）軟件進(jìn)行全因子試驗(yàn)分析，影響因子的確定采用方差分析法。

2 結(jié)果與分析

2.1 混菌發(fā)酵羊乳生產(chǎn)條件優(yōu)化的全因子試驗(yàn)

對(duì)菌株LB6和ST混合發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵羊乳的條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵羊乳的ACE抑制率、活菌數(shù)及感官評(píng)分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 羊乳發(fā)酵條件優(yōu)化全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of full factorial experiments for goat milk fermentation conditions optimization

采用JMP10 Pro軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，得到ACE抑制率、活菌數(shù)以及感官評(píng)分的方差分析。

2.1.1 ACE抑制率的方差分析

對(duì)混菌發(fā)酵羊乳ACE抑制率進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 發(fā)酵羊乳ACE抑制率的全因子試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of full factorial experiments results for ACE inhibition rate of fermented goat milk

由表3可知，菌株LB6和ST混菌發(fā)酵羊乳ACE抑制率的方差分析模型（P＜0.05）顯著，各因素對(duì)ACE抑制率無(wú)顯著影響（P＞0.05），影響順序?yàn)锽＞AB＞A＞BC＞C＞AC。

2.1.2 活菌數(shù)的方差分析

對(duì)混菌發(fā)酵羊乳的活菌數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，菌株LB6和ST混菌發(fā)酵羊乳活菌數(shù)的主要影響因素為發(fā)酵時(shí)間和菌株比例，其他因素?zé)o顯著影響（P＞0.05）。各因素對(duì)活菌數(shù)的影響順序?yàn)镃＞A＞AC＞B＞BC＞AB。

表4 發(fā)酵羊乳活菌數(shù)的全因子試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of full factorial experiments results for viable counts of fermented goat milk

2.1.3 感官評(píng)價(jià)的方差分析

對(duì)混菌發(fā)酵羊乳的感官評(píng)價(jià)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 發(fā)酵羊乳感官評(píng)價(jià)的全因子試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of full factorial experiments results for sensory evaluation of fermented goat milk

由表5可知，菌株LB6及ST發(fā)酵羊乳感官評(píng)價(jià)的主要影響因素為發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互項(xiàng)（P＜0.01），其他項(xiàng)無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。影響順序?yàn)锽C＞C＞B＞AC＞AB＞A。

2.1.4 菌株LB6和ST混合發(fā)酵羊乳發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵羊乳發(fā)酵條件的全因子試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果如圖1所示。

圖1 羊乳發(fā)酵條件的主因子優(yōu)化圖Fig.1 Optimization of main factors for fermentation conditions of goat milk

由圖1可知，根據(jù)預(yù)測(cè)刻畫(huà)器，兼顧各項(xiàng)指標(biāo)（ACE抑制率＞80%，活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)越大越好）得出，發(fā)酵羊乳的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為菌株比例1∶1，發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵時(shí)間為3.5h。在此條件下，其ACE抑制率預(yù)測(cè)值為84.56%，活菌數(shù)OD600nm值為0.28，感官評(píng)價(jià)為7.29分。

對(duì)上述最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得其ACE抑制率、活菌數(shù)OD600nm值、感官評(píng)分分別為（78.37±0.53）%、0.22±0.01、（7.35±0.25）分，其中活菌數(shù)與預(yù)測(cè)值0.28相差較遠(yuǎn)，分析原因可能是活菌數(shù)受多種因素影響。其余項(xiàng)指標(biāo)與預(yù)測(cè)值比較接近。

2.2 冷藏過(guò)程對(duì)混菌發(fā)酵羊乳的影響

2.2.1 冷藏過(guò)程中混菌發(fā)酵羊乳pH值、酸度和活菌數(shù)的變化

冷藏過(guò)程中，混菌發(fā)酵羊乳的pH值、酸度和活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 冷藏過(guò)程中混菌發(fā)酵羊乳pH值、酸度和活菌數(shù)的變化Fig.2 Changes of pH value,acidity and viable counts of fermented goat milk by mixed fermentation during refrigeration

發(fā)酵羊乳中的活菌數(shù)會(huì)受多種因素影響，如冷藏溫度、pH值和酸度以及各種菌種之間的作用等[22]，由圖2可知，發(fā)酵羊乳的pH值隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品冷藏0～7 d，pH值降低較慢，只下降了0.1（3.94～3.84）；但冷藏7～14 d下降速度變快，pH值降低0.6（3.84～3.24）；冷藏14 d后酸化速度變緩，在14～28 d內(nèi)，pH值僅降低了0.1（3.24～3.14），由此可知，冷藏7～14 d是酸化發(fā)生的主要時(shí)期。

酸度基本與其pH值相對(duì)應(yīng)，發(fā)酵羊乳的酸度隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大。分析原因可能是在冷藏過(guò)程中，保加利亞乳桿菌LB6繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，菌體的生長(zhǎng)消耗殘存的乳糖產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致酸度進(jìn)一步升高。因菌株LB6與ST的產(chǎn)酸能力較強(qiáng)[23]，故冷藏0～14 d，酸度一直迅速增長(zhǎng)，冷藏14～28 d，酸度趨于穩(wěn)定，酸度達(dá)到180°T。而國(guó)標(biāo)GB.19302—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中規(guī)定酸牛奶的酸度≥70.0°T時(shí)終止發(fā)酵，酸乳制品的酸度應(yīng)該在70.0～110.0°T。而本研究發(fā)現(xiàn)，酸牛奶的國(guó)標(biāo)可以作為參考，但并不能完全適用于發(fā)酵羊乳。因?yàn)樗岫仍?0.0～80.0°T時(shí)，不能使羊奶中的蛋白形成固體狀酸凝乳。通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，酸羊乳發(fā)酵終止酸度應(yīng)在90.0°T左右較合適，即使發(fā)酵羊乳冷藏后酸度達(dá)到150.0°T，在感官評(píng)價(jià)時(shí)依然可以接受。

在冷藏過(guò)程中，發(fā)酵羊乳的總活菌數(shù)隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先增大后減小趨勢(shì)。總活菌數(shù)在冷藏7d時(shí)達(dá)到最大值（OD600nm值=0.32）。雖然低溫低酸的環(huán)境已經(jīng)不再適合菌體的生長(zhǎng)，但由于生長(zhǎng)慣性，菌體數(shù)量在冷藏1～7 d內(nèi)仍呈上升趨勢(shì)。而隨著冷藏過(guò)程中酸羊乳pH的下降和酸度的升高，菌體生長(zhǎng)受到其代謝產(chǎn)物的抑制，則加劇了菌體的死亡，從而導(dǎo)致7～28 d內(nèi)總活菌數(shù)逐漸下降。

2.2.2 冷藏過(guò)程中發(fā)酵羊乳ACE抑制率和感官評(píng)價(jià)的變化

ACE抑制率的大小直接關(guān)乎發(fā)酵養(yǎng)乳中ACE抑制肽活性的大小，ACE抑制率越大說(shuō)明抑制肽活性越高，那么降血壓的效果也就越好。綜合色澤、氣味、滋味、組織結(jié)構(gòu)四項(xiàng)對(duì)發(fā)酵羊乳進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，發(fā)酵羊乳的ACE抑制率和感官評(píng)價(jià)見(jiàn)圖3。

圖3 冷藏過(guò)程中混菌發(fā)酵羊乳ACE抑制率與感官評(píng)價(jià)的變化Fig.3 Changes of ACE inhibition rate and sensory evaluation of fermented goat milk by mixed fermentation during refrigeration

由圖3可知，在發(fā)酵3 d內(nèi)，發(fā)酵羊乳的ACE抑制率有所增加，發(fā)酵3d時(shí)ACE抑制率達(dá)到76.16%，低于SHUGW等[24]以L.plantarumLP69單菌株發(fā)酵羊乳的ACE抑制率（84.27%），高于以L.bulgaricusLB6單菌株發(fā)酵的酸羊乳ACE抑制率（74.70%）；發(fā)酵3d以后，ACE抑制率逐漸減??；發(fā)酵28 d時(shí)，ACE抑制率下降至20.19%，說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中ACE抑制肽的損失相當(dāng)嚴(yán)重，分析原因可能是冷藏過(guò)程中菌體破壞了抑制肽的生物結(jié)構(gòu)。

發(fā)酵羊乳在冷藏3 d時(shí)，感官評(píng)分最高為8.24分，此時(shí)口感最佳，酸甜適中，膻味較輕；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酸化越來(lái)越嚴(yán)重，致使發(fā)酵羊乳過(guò)酸，使人無(wú)法接受，因此感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)逐漸降低（7.83～7.23分）。

2.2.3 冷藏過(guò)程中發(fā)酵羊乳質(zhì)構(gòu)的變化

冷藏過(guò)程中發(fā)酵羊乳的質(zhì)構(gòu)特性變化結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 冷藏過(guò)程中發(fā)酵羊乳質(zhì)構(gòu)特性的變化Fig.4 Changes of texture properties of fermented goat milk during refrigeration process

由圖4可知，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵羊乳的硬度、稠度、凝聚性和黏度均呈先增大后減小的趨勢(shì)。其中，發(fā)酵羊乳的硬度在冷藏14 d時(shí)達(dá)到最大值（0.078 g），冷藏14～21 d內(nèi)隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)硬度逐漸減小，21～28 d時(shí)硬度變化趨于平緩；發(fā)酵羊乳的稠度在冷藏7 d時(shí)，稠度達(dá)到最大，為1.43 g；而凝聚性與黏度分別在冷藏3 d（0.078 g）和7d（0.179g·s）時(shí)達(dá)到最大。本研究得到的發(fā)酵羊乳在4℃條件下冷藏期達(dá)到14 d時(shí)，發(fā)酵羊乳的質(zhì)構(gòu)特性最佳：硬度為0.078g、稠度為1.92g·s、凝聚性為0.078g、黏度為0.179g·s。3結(jié)論

全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到混菌發(fā)酵羊乳的最佳發(fā)酵條件為菌株比例LB6∶ST=1∶1，發(fā)酵溫度42 ℃，發(fā)酵時(shí)間3.5 h。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，發(fā)酵羊乳的ACE抑制率、活菌數(shù)OD600nm值和感官評(píng)分分別為78.37%、0.22、7.35分。在冷藏過(guò)程中，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵羊乳的pH值逐漸減小，酸度逐漸增大，感官評(píng)分、ACE抑制率、活菌數(shù)、硬度、稠度、凝聚性與黏度均呈先增大后減小的趨勢(shì)。