廣西地區(qū)青年人腸道乳酸菌的分離及其發(fā)酵酸奶品質(zhì)的評價

楊發(fā)容，董 蘊(yùn)，單春會，蔡文超，郭 壯，張振東*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 襄陽 441053；2.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

酸奶是利用新鮮的動物乳或奶粉和白糖混勻，再加入菌種發(fā)酵的乳制品，發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)過低溫冷藏而成[1]。酸奶能維持并改善人體腸道菌群平衡，降低人體膽固醇，有效改善便秘，還有預(yù)防衰老等作用。由于酸奶中的蛋白質(zhì)易被人體消化吸收，能緩解乳糖不耐癥，所以較適合兒童和病人食用[2]。酸奶因風(fēng)味獨(dú)特而多樣，營養(yǎng)價值較高而越來越受到人們的歡迎。乳酸菌發(fā)酵劑是影響酸奶風(fēng)味與滋味的主要因素之一[3]。采用不同的乳酸菌發(fā)酵劑發(fā)酵的酸奶，它們最終的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味和口感會具有不同的特點(diǎn)[4]。

乳酸菌是一類革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，可以發(fā)酵糖產(chǎn)生乳酸的無芽孢類細(xì)菌[5]。自然界中的乳酸菌種類很多，包括乳球菌屬（Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、鏈球菌屬（Streptococcus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等多個屬，在發(fā)酵食品中，人或動物的腸道等環(huán)境中都有分布[6]。本研究從6名廣西青年人志愿者的糞便樣品，通過倍比稀釋涂布法，進(jìn)行乳酸菌的分離與鑒定，并利用這些乳酸菌進(jìn)行酸奶的發(fā)酵制作，評價酸奶的品質(zhì)，以期尋找到發(fā)酵品質(zhì)較好的乳酸菌菌株，為酸奶發(fā)酵劑的開發(fā)提供乳酸菌資源，并為酸奶行業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新西蘭恒天然全脂奶粉：新西蘭恒天然集團(tuán)；胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖（均為生化試劑）、氯化鈉（分析純）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Axygen聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：康寧生命科學(xué)吳江有限公司；rTaq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL），10×PCR buffer（含有Mg2+），脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）mixture（2.5 mmol/L），pMD18-T克隆載體：寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α：實(shí)驗(yàn)室保存；27F與1492R（10 μmol/L）：由金斯瑞生物科技有限公司合成。糞便樣品：采集自廣西青年人志愿者。

MRS固體培養(yǎng)基：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DG250厭氧工作站：英國DWS公司；Vetiri梯度基因擴(kuò)增儀：美國AB公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；PEN3電子鼻（配備W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W和W3S傳感器）：德國Airsense公司；YXQ-L31-400立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SA-402B電子舌（配備CA0、C00、AE1、CT0和AAE測試傳感器）：日本Insent公司：LC-20ADXR高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配備Inertsil C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm））：日本日立公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司；CYB40-10S高壓均質(zhì)機(jī)：上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離與純化

糞便樣品采集到樣品瓶后，裝入冰袋降溫的樣品箱，進(jìn)行乳酸菌的分離。將糞便樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，取10-5與10-6梯度的稀釋液，涂布于含有1.0%的碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上，置于厭氧（85%N2、5%CO2和10%H2）、37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。使用經(jīng)灼燒并冷卻后的無菌接種環(huán)挑取菌落形態(tài)具有明顯差異且具有透明圈的菌落，在MRS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線，待長出單菌落后，繼續(xù)挑取單菌落劃線培養(yǎng)，連續(xù)3次。待菌落純化完成后，進(jìn)行革蘭氏法染色，并用光學(xué)顯微鏡鏡檢，同時進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)。選取革蘭氏染色呈陽性，具有透明圈的菌株為待定的乳酸菌菌株，使用30%甘油保存于-80℃冰箱[7]。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

乳酸菌基因組DNA的提取參照MVE-OBIANG A等[8]的方法進(jìn)行。以提取到的乳酸菌總DNA為模板，以16SrRNA基因通用引物27F與1492R[9-10]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系[9]：10×PCR緩沖液5 μL，dNTP混合物（2.5 mmol/L）4 μL，引物27F（10 mmol/L）1 μL，1492R（10 mmol/L）1 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，DNA模板約10 ng，補(bǔ)充無菌純水至50 μL。PCR擴(kuò)增程序[9]：94℃、5min；94℃、45s，55℃、45s，72℃、90s，30次循環(huán)；72℃、10 min[11]。使用Axygen PCR清潔試劑盒純化PCR產(chǎn)物后，使用克隆載體pMD18-T進(jìn)行TA克隆，挑選陽性克隆子送南京金斯利生物技術(shù)有限公司測序。獲得的序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并選擇序列相似度較高的乳酸菌模式種序列，使用MEGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.3.3 酸奶的加工工藝及操作要點(diǎn)[12]

熱水（60℃）→原料（奶粉、白砂糖）→均質(zhì)→95℃保溫5min→降溫至4℃→接入乳酸菌發(fā)酵劑→42℃發(fā)酵（pH至4.5終止發(fā)酵）→冷卻后熟→成品

操作要點(diǎn)：首先稱取23g奶粉和13g白砂糖，加入164mL加熱至（60±1）℃的純水，攪拌混勻并進(jìn)行高壓均質(zhì)（一段20 MPa，二段4 MPa），然后將均質(zhì)后的乳液保持在95℃、5min進(jìn)行巴氏殺菌。待殺菌后冷卻至42℃，按照5×106CFU/mL復(fù)原乳的比例接入活化乳酸菌發(fā)酵劑，同時設(shè)置未接菌處理作為對照組。將所有酸奶處理放入培養(yǎng)箱42℃條件下發(fā)酵24 h，待發(fā)酵至pH=4.5時將酸奶在冷水中迅速冷卻以終止發(fā)酵，然后置于4℃保持24 h進(jìn)行酸奶的后熟，得酸奶成品。

乳酸菌的活化：首先將存放在-70℃的凍存乳酸菌使用MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，連續(xù)活化3次，作為乳酸菌種子液。參照衛(wèi)生部辦公廳頒發(fā)的《可用于食品的菌種名單》[13]，選取分離到的23株乳酸菌中的20株菌作為酸奶乳酸菌發(fā)酵劑進(jìn)行酸奶的發(fā)酵制作。

1.3.4 分析檢測

（1）酸奶氣味的檢測

稱取15 mL酸奶樣品，移入樣品瓶中，將樣品置于55℃恒溫水浴10 min，室溫平衡30 min，然后參照楊成聰?shù)萚14]的方法使用電子鼻探頭進(jìn)行測定：設(shè)定清洗時間為150 s，探針插入時間5 s，自動調(diào)零時間5 s，測試時間60 s，注射流速120 mL/min，內(nèi)部流速120 mL/min。

（2）酸奶滋味的測定

酸奶樣品處理：取100 mL去離子水與50 mL酸奶樣品混勻，室溫條件下3 000 r/min離心10 min，用濾紙過濾離心后的上清液，并收集濾液。酸奶的滋味測定參照王玉榮等[15]的方法：用SA 402B電子舌測定酸奶樣品的酸、苦、澀、咸、鮮、回味A（澀味的回味）、B（苦味的回味）和豐度（鮮味的回味）等8個指標(biāo)的相對強(qiáng)度。

（3）酸奶有機(jī)酸含量的測定

酸奶樣品的前處理參照田輝等[16]的方法進(jìn)行。樣品前處理：取2 mL酸奶與50 μL 68%的硝酸混合，使用流動相定容至10 mL，10 000×g離心10 min。取上清液于試管中在121℃保持15min滅菌，10000×g離心10min，用槍頭取上清液裝于EP管中。用1mL注射器吸取中間層清液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾到進(jìn)樣瓶中約1.0 mL。

使用HPLC法進(jìn)行有機(jī)酸的測定，色譜條件：色譜柱為 Inertsil C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），進(jìn)樣量20 μL，柱溫為30℃，紫外檢測器檢測波長設(shè)定為215 nm，流速為1.0 mL/min，流動相是pH=2.30的磷酸二氫鉀溶液（濃度為0.01 mol/L）。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

獲得的數(shù)據(jù)使用SPSS18.0分析，使用Origin8.5繪圖。系統(tǒng)發(fā)育樹使用MEGA7.0構(gòu)建。使用主成分分析（principle components analysis，PCA）法對酸奶滋味與氣味進(jìn)行綜合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

部分乳酸菌的在MRS固體平板上生長2 d后的菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 部分乳酸菌分離株的菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Morphology of cells and colonies of part isolated lactic acid bacteria

廣西地區(qū)青年人糞便樣品通過倍比稀釋，使用MRS培養(yǎng)基分離得到23株菌。由于乳酸菌產(chǎn)生乳酸，能將加入到MRS培養(yǎng)基中的碳酸鈣溶解掉，形成透明圈，所以將能形成透明圈，革蘭氏陽性，過氧化氫酶測定結(jié)果為陰性的23株菌，初步判定為乳酸菌[17]，對其進(jìn)行純化與保存，進(jìn)一步對分離到的乳酸菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察（見圖1），分子生物學(xué)鑒定，并基于細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。

2.2 乳酸菌的鑒定

對分離菌的16S rRNA基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。由圖2可知，獲得的PCR產(chǎn)物為1 500 bp左右，與細(xì)菌16S rRNA基因的大小相符，且條帶整齊，明亮，滿足下一步進(jìn)行基因克隆的需求。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、TA克隆，選取陽性克隆子進(jìn)行測序，獲得了這23株乳酸菌的16SrRNA基因的序列。將這些序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果見表1，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖2 部分乳酸菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of PCR amplification products of 16S rRNA gene from part isolated lactic acid bacteria

表1 乳酸菌的16S rRNA基因序列比對結(jié)果Table 1 Alignment results of 16S rRNA gene sequences of the lactic acid bacteria

續(xù)表

圖3 乳酸菌基于16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria based on 16S rRNA sequences

由表1和圖3可知，菌株HBUAS54271、HBUAS54217、HBUAS54220、HBUAS54222、HBUAS54224、HBUAS54225、HBUAS54234、HBUAS54238、HBUAS54260、HBUAS54318、和HBUAS54292與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）的菌株同源性最高（＞99%），鑒定為發(fā)酵乳桿菌；菌株HBUAS54223、HBUAS54230、HBUAS54248、HBUAS54250、HBUAS54317、和HBUAS54285 6株菌與唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）模式菌的16S rRNA同源性最高，鑒定為唾液乳桿菌；菌株HBUAS54235和HBUAS54236與融合魏斯氏菌（Weissella confuse）模式菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，鑒定為融合魏斯氏菌；菌株HBUAS54233和HBUAS54288與格氏乳桿菌模式菌ATCC 33323T的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，鑒定為格氏乳桿菌（Lactobacillusgasseri）；菌株HBUAS54286與口乳桿菌（Lactobacillus oris）模式菌F0423T的菌株同源性＞99%，所以將其鑒定為口乳桿菌；菌株HBUAS54287與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）模式菌的同源性最高，鑒定為副干酪乳桿菌。

本研究從廣西青年人腸道共分離出23株乳酸菌，通過16S rRNA序列分析將這些乳酸菌鑒定為6個種，分別為發(fā)酵乳桿菌、唾液乳桿菌、融合魏斯氏菌、格氏乳桿菌、口乳桿菌和副干酪乳桿菌。其中發(fā)酵乳桿菌有11株，占所分離菌株總數(shù)的48%，唾液乳桿菌有6株，所占比例為26%，格氏乳桿菌有2株，所占比例為9%，副干酪乳桿菌有1株，占所有菌株總數(shù)的4%，融合魏斯氏菌有2株，所占比例為9%，口乳桿菌有1株，占所有菌株總數(shù)的4%。選取其中的20株菌，進(jìn)行酸奶發(fā)酵制作與品質(zhì)評價，以探明這些乳酸菌的酸奶發(fā)酵特性。

2.3 不同乳酸菌發(fā)酵對酸奶氣味的作用

酸奶氣味是酸奶品質(zhì)的重要組成部分。在酸奶發(fā)酵制作時，乳酸菌對酸奶氣味形成的特性是篩選優(yōu)良乳酸菌發(fā)酵劑的重要因素。因此對發(fā)酵完成的酸奶通過電子鼻進(jìn)行了氣味測定，結(jié)果見表2。

由表2可知，各傳感器對添加不同乳酸菌發(fā)酵劑的酸奶樣品有不同的響應(yīng)值，其中傳感器W1S、W1W的響應(yīng)值的差異較大，極差值分別為6.98和5.37，表明傳感器W1S、W1W針對甲烷、有機(jī)硫化物，與萜類氣味物質(zhì)具有較強(qiáng)靈敏性，且分離到的乳酸菌發(fā)酵酸奶過程中形成的甲烷、有機(jī)硫化物和萜類氣味物質(zhì)的差異較大。傳感器W5S、W2S和W2W的響應(yīng)值的極差值為1.72、2.73、1.78，說明對酸奶中的乙醇及氫氧化物也有一定的響應(yīng)。而傳感器W3C與W5C響應(yīng)的極差值分別為0.65和0.75，經(jīng)方差分析（anaylsis of variance，ANOVA），酸奶中芳香類物質(zhì)的差異并不顯著（P＞0.05）。

表2 不同乳酸菌發(fā)酵酸奶的氣味分析結(jié)果Table 2 Analysis results of aroma of yoghurt fermented with different lactic acid bacteria

2.4 不同乳酸菌發(fā)酵對酸奶滋味的作用

有機(jī)酸是乳酸菌在發(fā)酵乳品過程中代謝產(chǎn)生的，是影響酸奶滋味的重要因素之一。因此本研究利用電子舌對不同乳酸菌發(fā)酵的酸奶樣品的滋味品質(zhì)進(jìn)行了評價分析，各滋味指標(biāo)的相對強(qiáng)度值如圖4所示。

圖4 基于電子舌技術(shù)的酸奶樣品各滋味分析結(jié)果Fig.4 Analysis results of taste of yoghourt samples using electronic tongue

除外觀色澤與氣味品質(zhì)外，滋味品質(zhì)是另一項(xiàng)影響消費(fèi)者食品感官體驗(yàn)的重要因素。通過電子舌這種智能味覺分析系統(tǒng)對酸奶樣品的滋味品質(zhì)進(jìn)行了測定，酸奶樣品各項(xiàng)滋味指標(biāo)的相對強(qiáng)度值如圖4所示。由圖4可知，酸奶樣品中鮮味指標(biāo)的極差值＜1，說明不同乳酸菌對酸奶樣品的鮮味影響較小。酸奶樣品中酸味、苦味、澀味、咸味、后味A、后味B和豐度基本味的極差值均＞1，說明不同乳酸菌發(fā)酵制作的酸奶樣品之間酸味、苦味、澀味、咸味、后味A（澀味的回味）、后味B（苦味的回味）和豐度（鮮味的回味）基本味滋味品質(zhì)差異較大，反映出所選取乳酸菌的酸奶發(fā)酵特性各異。在這些滋味的基本味中，酸味、后味A和豐度的極值最大，極差值分別達(dá)到了11.99、10.85、12.54，是乳酸菌對酸奶滋味品質(zhì)影響的主要體現(xiàn)。

2.5 不同乳酸菌對酸奶有機(jī)酸的作用

由圖5可知，本研究中發(fā)酵的酸奶樣品中有機(jī)酸由乳酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸組成。其中酸奶樣品中的乳酸與乙酸含量最高，乳酸含量為0.77～8.74g/L，乙酸含量為0.92～8.98 g/L，因此不同的乳酸菌發(fā)酵制作的酸奶的乳酸與乙酸含量差異較大。與之相反的是，檸檬酸、蘋果酸，與琥珀酸的含量較低，檸檬酸含量為0～2.28 g/L，蘋果酸為0～0.08 g/L，琥珀酸為0～0.69 g/L。

圖5 酸奶樣品有機(jī)酸分析結(jié)果Fig.5 Analysis results of organic acids in the yoghourt samples

酸奶樣品中，副干酪乳桿菌HBUAS54287、唾液乳桿菌HBUAS54223與HBUAS54248、格氏乳桿菌HBUAS54233、發(fā)酵乳桿菌HBUAS54238與HBUAS54318發(fā)酵制作的酸奶中乳酸含量最高，均＞5.5g/L，顯著高于其他樣品（P＜0.05），說明它們發(fā)酵產(chǎn)生乳酸能力較強(qiáng)。同時這些乳酸菌發(fā)酵的酸奶樣品，除唾液乳桿菌HBUAS54248與發(fā)酵乳桿菌HBUAS54238外，樣品中乙酸含量均＜2g/L。因此，由于本次分離到的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生芳香類物質(zhì)的差異不大，根據(jù)其乳酸發(fā)酵特性，副干酪乳桿菌HBUAS54287、唾液乳桿菌HBUAS54223與HBUAS54248、格氏乳桿菌HBUAS54233、發(fā)酵乳桿菌HBUAS54238與HBUAS54318都是適用于酸奶發(fā)酵的候選發(fā)酵劑的開發(fā)菌株。

2.6 基于酸奶滋味與氣味的PCA分析

本研究利用主成分分析軟件SAS評價了乳酸菌對酸奶口感品質(zhì)的影響。主成分1和主成分2的2因子載荷圖如圖6所示。由圖6可知，第一主成分由酸味、澀味和后味A（澀味的回味）3個酸奶特征性滋味指標(biāo)構(gòu)成并且占全部變量的44.64%，各傳感器與特征性滋味指標(biāo)分布在各個象限，傳感器W1W與W2W的分離度較明顯，與W5S的分離度則不明顯。而第一主成分傳感器響應(yīng)實(shí)驗(yàn)主要分布在第二、三、四象限，其中對芳香類物質(zhì)較敏感的傳感器都在第四象限且分離度不明顯。

酸奶滋味品質(zhì)的主成分1與主成分2因子得分圖如圖7所示。由圖7可知，由酸奶樣品中各主成分的方差貢獻(xiàn)率和特征值可得出，前4個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為86.55%。11株發(fā)酵乳桿菌HBUAS54217、HBUAS54225、HBUAS54292、HBUAS54318、HBUAS54220、HBUAS54271、HBUAS54224、HBUAS54222、HBUAS54238、HBUAS54260與HBUAS54234發(fā)酵的酸奶樣品聚集分布在最左側(cè)（第二與第三象限），9株唾液乳桿菌HBUAS54285、HBUAS54233、HBUAS54287、HBUAS54317、HBUAS54248、HBUAS54223、HBUAS54288、HBUAS54250和HBUAS54230發(fā)酵的酸奶聚類分布在最右側(cè)（第一與第四象限）。2株格氏乳桿菌HBUAS54233與HBUAS54288發(fā)酵的酸奶樣品分別在第一與第四象限，距離較近。結(jié)果表明，屬于同一分類單元的乳酸菌，發(fā)酵產(chǎn)生的酸奶滋味與氣味較為接近，在因子載荷圖上呈現(xiàn)出集中的趨勢，可能是因?yàn)槠浠蚪M成相近，代謝類型相似。因此，要使酸奶具有多樣的滋味與風(fēng)味，就需要多種乳酸菌進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵。

圖7 基于酸奶滋味與氣味的主成分分析因子得分圖Fig.7 Factors score chart by PCA based on the taste and aroma of the yoghourt

3 結(jié)論

本研究表明，廣西青年人腸道乳酸菌多樣性較高，從6名志愿者糞便樣品中共分離得到23株乳酸菌，鑒定為魏斯氏菌屬和乳桿菌屬共2個菌屬，6個種，其中有11株被鑒定為發(fā)酵乳桿菌，占到總分離菌的47.83%。對酸奶品質(zhì)的分析表明，使用所分離到的乳酸菌發(fā)酵制作的酸奶樣品間芳香類物質(zhì)無顯著差異（P＜0.05），而酸味具有較大差異。進(jìn)一步分析表明，酸奶樣品酸味的差異由有機(jī)酸乳酸與乙酸的含量引起，其中副干酪乳桿菌HBUAS54287、唾液乳桿菌HBUAS54223與HBUAS54248、格氏乳桿菌HBUAS54233、發(fā)酵乳桿菌HBUAS54238與HBUAS54318乳酸產(chǎn)生能力較強(qiáng)，可用于酸奶發(fā)酵的復(fù)合發(fā)酵劑乳酸菌的篩選。多元統(tǒng)計(jì)分析表明，采用分離到的屬于同一分類單元（種）乳酸菌發(fā)酵制作的酸奶，氣味與滋味相似，在基于PCA的載荷圖上分布集中。