非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵柿子酒特性的研究

荊 雄，楊 輝*，蘇 文，董騰達(dá)，黃莎莎

（陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

我國(guó)柿子種植面積廣、產(chǎn)量高，特別是近年來(lái)柿子產(chǎn)量大幅度提高，而柿子鮮食消費(fèi)市場(chǎng)卻相對(duì)有限，柿子成熟后一旦不及時(shí)采摘加工，很容易軟化、腐爛，造成極大經(jīng)濟(jì)損失[1]。由于柿子中具有豐富的生物活性物質(zhì)（如甘露醇、果糖、五環(huán)三萜類化合物、維生素和大量的鞣質(zhì)等），因此可以做成高檔調(diào)味品、柿子酒和各種保健品等[2-4]。

我國(guó)柿子酒的生產(chǎn)工業(yè)中多采用商用酵母單菌發(fā)酵，這類酵母具備耐高溫、耐高酒精的特征，可確保果酒品質(zhì)[5]。但由于商用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生產(chǎn)的果酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量較少，缺少酯香，導(dǎo)致口感和風(fēng)味不佳，不能很好地滿足市場(chǎng)的需求[6]。隨著人們對(duì)葡萄酒研究的深入，王志恒等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄酒自然釀造過(guò)程中存在大量的非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae），這些非釀酒酵母對(duì)葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生具有重要作用。非釀酒酵母是有別于釀酒酵母的一大類酵母，主要包括克勒克酵母屬（Kloeckera）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）和伊薩酵母屬（Issatchenkia）等[8]。

與釀酒酵母相比，非釀酒酵母能產(chǎn)生更多種類的胞外酶將葡萄酒中的香氣前體物質(zhì)分解從而釋放出香氣物質(zhì)[9-11]，如能夠分泌蛋白酶、果膠酶、纖維素酶等[12]。而水解香氣糖苷形成揮發(fā)性香氣成分的關(guān)鍵酶是β-葡萄糖苷酶[13]，β-葡萄糖苷酶具有獨(dú)特的水解活性，可以從香氣前體物質(zhì)的末端非還原性β-D-糖苷鍵中釋放出非還原性糖基[14]，賦予葡萄酒更好的花香、果香味[15]。因此可以將在葡萄酒釀造中發(fā)現(xiàn)的非釀酒酵母引用到柿子酒的釀造中，以此提高柿子酒的質(zhì)量。

目前我國(guó)對(duì)非釀酒酵母的研究尚處于起步階段，工業(yè)發(fā)酵菌株亟待開(kāi)發(fā)。因此本研究選用兩種不同類型非釀酒酵母：檸檬形克勒克酵母（Klockera apiculata）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），在對(duì)兩種非釀酒酵母耐受性研究的基礎(chǔ)上，對(duì)兩種非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵柿子酒的發(fā)酵特性進(jìn)行研究，為非釀酒酵母在柿子酒生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為其他果酒發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Z2：本實(shí)驗(yàn)室提供，保藏方式為凍干粉；檸檬克勒克酵母（Klockera apiculata）31232、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）1344：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，提供方式為凍干粉。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉（純度≥96%）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；檸檬酸、蔗糖（純度≥98%）：濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、次甲基藍(lán)（純度≥98%）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；單寧（純度≥98%）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基為酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。

選擇培養(yǎng)基為YPD固體（yeast extract peptone agar，YPDA）培養(yǎng)基：在YPD培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加2%瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基為純柿子汁（經(jīng)過(guò)打漿、酶解、榨汁、調(diào)糖調(diào)酸得到），調(diào)整pH為4.0，將初始可溶性固形物調(diào)為20°Bx，還原糖含量為128.86 g/L，總酸含量為8.64 g/L。

上述培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型pH計(jì)、78-1磁力攪拌器：上海儀電科學(xué)器股份有限公司；PL203電子天平：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；SP-756P紫外可見(jiàn)分光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；DSX-280B蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；WMK-08恒溫培養(yǎng)箱：山東濰坊醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

取三種保藏的酵母凍干粉分別加入含有2%葡萄糖的無(wú)菌水中，37℃恒溫復(fù)水20 min；取2%的菌懸液接種至YPD培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)1 d，稀釋涂布于YPDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2d，在固體培養(yǎng)基上挑取菌落特征明顯的菌株接種于YPD培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)2 d制成種子液，放于冰箱中保藏備用。

1.3.2 兩種非釀酒酵母對(duì)酒精的耐受性

將1.3.1活化好的兩種非釀酒酵母種子液分別按2%接種量接種于酒精度為0、2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol的YPD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24h，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定酵母菌液在波長(zhǎng)630 nm處的OD630nm值。

1.3.3 兩種非釀酒酵母對(duì)單寧的耐受性

將1.3.1活化好的兩種非釀酒酵母分別按2%接種量接種于0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L不同單寧含量的YPD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h，通過(guò)血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4 兩種非釀酒酵母對(duì)SO2的耐受性

將1.3.1活化好的兩種非釀酒酵母種子液分別按2%接種量接種于SO2質(zhì)量濃度分別為50mg/L、100mg/L、150mg/L、200 mg/L、250 mg/L的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h之后，使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定酵母菌液在波長(zhǎng)630 nm處的OD630nm值。

1.3.5 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力試驗(yàn)

將3種酵母分別梯度稀釋后涂布于以纖維二糖為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2 d后觀察酵母生長(zhǎng)情況。

1.3.6 發(fā)酵性能試驗(yàn)

將釀酒酵母和兩株非釀酒酵母分別單獨(dú)接種于柿子汁中，于25℃靜置培養(yǎng)7 d進(jìn)行單菌發(fā)酵試驗(yàn)；同時(shí)以相同發(fā)酵條件將兩株非釀酒酵母分別與釀酒酵母按照1∶1混合接種于柿子汁中進(jìn)行混菌發(fā)酵試驗(yàn)（其中混1表示檸檬形克勒克酵母與釀酒酵母，混2表示東方伊薩酵母與釀酒酵母）；每隔24 h取樣，測(cè)定單菌、混菌發(fā)酵過(guò)程培養(yǎng)基中還原糖、總酸、pH、酒精度等變化情況。

1.3.7 分析檢測(cè)

（1）發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的測(cè)定[16]：還原糖采用斐林試劑法測(cè)定；總酸采用電位滴定法測(cè)定；酒精含量采用密度瓶法。

（2）酵母發(fā)酵性能[17]：采用CO2失重法。每隔24h稱質(zhì)量一次，直至發(fā)酵結(jié)束。

（3）酵母計(jì)數(shù)[18]：采用改良的麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基：添加40 mg/L的溴酚藍(lán)，pH4.6。在該培養(yǎng)基上檸檬形克勒克酵母的菌落泛藍(lán)，東方伊薩酵母菌落呈藍(lán)色，且菌落較大，釀酒酵母則是白色微泛黃菌落，根據(jù)菌落形態(tài)特征的不同進(jìn)行酵母計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種非釀酒酵母對(duì)酒精的耐受性

兩種非釀酒酵母對(duì)酒精的耐受性結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，當(dāng)酒精度＞4%vol之后，檸檬形克勒克酵母生長(zhǎng)嚴(yán)重受到抑制，而對(duì)東方伊薩酵母生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響；當(dāng)酒精度＞8%vol之后，東方伊薩酵母生長(zhǎng)開(kāi)始受到抑制，而檸檬形克勒克酵母幾乎不能生長(zhǎng)。由此可以得出，東方伊薩酵母相比于檸檬形克勒克酵母對(duì)酒精耐受性更好。

圖1 非釀酒酵母對(duì)酒精的耐受性Fig.1 Tolerance of non-Saccharomycesto ethanol

2.2 兩種非釀酒酵母對(duì)單寧的耐受性

由于柿子中單寧含量較高，單寧與蛋白質(zhì)可發(fā)生沉淀反應(yīng)，因而過(guò)高的單寧含量會(huì)對(duì)酵母的生長(zhǎng)起到抑制作用。經(jīng)測(cè)定新鮮柿子經(jīng)過(guò)脫澀、酶解、榨汁處理后柿子汁中單寧含量在0.2～0.4g/L之間，兩種酵母對(duì)單寧的耐受性結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，兩種非釀酒酵母在單寧添加量為0.1～0.5g/L時(shí)，酵母數(shù)量都有略微的下降，但菌體數(shù)量都能維持在108CFU/mL以上。因此，兩株非釀酒酵母在柿子汁中仍可以保持較高數(shù)量生長(zhǎng)。

圖2 非釀酒酵母對(duì)單寧的耐受性Fig.2 Tolerance of non-Saccharomycesto tannin

2.3 兩種非釀酒酵母對(duì)SO2的耐受性

圖3 非釀酒酵母對(duì)SO2的耐受性Fig.3 Tolerance of non-Saccharomycesto SO2

在果酒的釀造過(guò)程中，需要加入少量的SO2來(lái)防止雜菌的污染，同時(shí)還能夠起到抗氧化及護(hù)色的作用[19]。SO2質(zhì)量濃度對(duì)兩種酵母生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可知，兩種非釀酒酵母生長(zhǎng)量隨著SO2質(zhì)量濃度的增加都有所降低，但降低幅度都較?。辉赟O2質(zhì)量濃度＜100 mg/L之前，酵母生長(zhǎng)良好，有輕微抑制作用。

2.4 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力試驗(yàn)

圖4為三種酵母經(jīng)過(guò)梯度稀釋涂布后在纖維二糖固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d的生長(zhǎng)情況，從圖中可以看出檸檬形克勒克酵母數(shù)量較多，能夠很好的利用纖維二糖進(jìn)行生長(zhǎng)，其次為東方伊薩酵母，釀酒酵母培養(yǎng)2 d后只有兩個(gè)酵母生長(zhǎng)出來(lái)，并且酵母形態(tài)偏小，生長(zhǎng)速度緩慢。從三種酵母在纖維二糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況可以得出，檸檬形克勒克酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力最強(qiáng)，其次為東方伊薩酵母，釀酒酵母最弱。

圖4 酵母菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力Fig.4 The β-glucosidase producing ability of yeasts

2.5 發(fā)酵性能試驗(yàn)

2.5.1 發(fā)酵過(guò)程中還原糖和酒精度變化

兩種酵母在發(fā)酵過(guò)程中還原糖和酒精度變化結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5（A）可知，不同發(fā)酵方式下發(fā)酵液中還原糖含量的變化，無(wú)論是釀酒酵母單菌發(fā)酵還是與非釀酒酵母混合菌發(fā)酵，在發(fā)酵48 h后發(fā)酵液中還原糖消耗殆盡，而兩種非釀酒酵母在發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中還原糖含量都保持較高水平，檸檬形克勒克酵母殘?zhí)橇孔罡?。由圖5（B）可知，不同發(fā)酵方式下發(fā)酵液中酒精度的變化，其中發(fā)酵結(jié)束后釀酒酵母單菌發(fā)酵酒精度最高達(dá)到11%vol，檸檬形克勒克酵母和東方伊薩酵母產(chǎn)酒精能力較弱，分別為3.05%vol和4.51%vol，與圖5（A）中對(duì)還原糖的利用結(jié)果相一致。單純釀酒酵母、非釀酒和釀酒酵母混合菌種發(fā)酵中由于有釀酒酵母的存在可使還原糖降到很低，所得酒的酒精度高于非釀酒酵母發(fā)酵的酒精度。混合酵母發(fā)酵將非釀酒酵母増香提升酒的品質(zhì)與釀酒酵母的高效率發(fā)酵結(jié)合起來(lái)，可釀造出酒度高香氣豐富的高品質(zhì)發(fā)酵酒。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量（A）和酒精度（B）變化Fig.5 Changes of reducing sugar(A)and alcohol content(B)during fermentation process

2.5.2 發(fā)酵過(guò)程中pH和總酸變化

圖6 發(fā)酵過(guò)程中pH（A）和總酸含量（B）變化Fig.6 Changes of pH(A)and total acid content(B)during fermentation process

發(fā)酵醪液的pH或酸度是影響酵母發(fā)酵活力的重要因素之一，發(fā)酵過(guò)程中pH的變化對(duì)酵母活力有一定的影響，發(fā)酵過(guò)程中pH變化如圖6（A）所示，在發(fā)酵起始階段，由于釋放出來(lái)的二氧化碳較少，可能有部分二氧化碳溶解于醪液中，同時(shí)發(fā)酵初期酵母形成乙酸等酸性物質(zhì)，導(dǎo)致pH下降，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵速率加快，酒精度不斷上升，釀酒酵母單菌和混菌發(fā)酵液pH逐漸上升，直至最后發(fā)酵趨于穩(wěn)定，其pH也趨于穩(wěn)定。由圖6（B）可知，在發(fā)酵前2 d總酸含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與圖6A中pH變化相一致；之后在酒精發(fā)酵過(guò)程中酵母能夠產(chǎn)酸同時(shí)也具備分解有機(jī)酸的能力，使得總酸含量出現(xiàn)上下波動(dòng)的趨勢(shì)，直至發(fā)酵結(jié)束釀酒酵母發(fā)酵柿子酒醪液中總酸含量最低，說(shuō)明釀酒酵母分解有機(jī)酸能力較非釀酒酵母強(qiáng)。

2.5.3 發(fā)酵過(guò)程中酵母數(shù)量的變化

圖7 單菌發(fā)酵（A）及混合菌發(fā)酵（B）過(guò)程中酵母數(shù)量的變化Fig.7 Changes of yeast number during single strain fermentation(A)and mixed fermentation(B)

由圖7（A）可知，三種酵母單菌發(fā)酵過(guò)程中，在發(fā)酵24 h內(nèi)酵母數(shù)量均呈指數(shù)倍增長(zhǎng)，其中釀酒酵母發(fā)酵性能最好，酵母數(shù)量最高；之后隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酵母數(shù)量都能保持在一定水平。由圖7（B）可知，在混菌發(fā)酵中，發(fā)酵初期由于非釀酒酵母與釀酒酵母競(jìng)爭(zhēng)利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使得酵母數(shù)量都低于酵母單菌發(fā)酵；發(fā)酵48 h后混1中檸檬形克勒克酵母數(shù)量開(kāi)始急劇下降，直到發(fā)酵結(jié)束酵母基本上全部衰亡；混2中東方伊薩酵母數(shù)量也出現(xiàn)下降，但到發(fā)酵結(jié)束仍有一定數(shù)量東方伊薩酵母存在，這是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中酒精濃度逐漸升高，而東方伊薩酵母酒精耐受性較檸檬形克勒克酵母好，所以酵母存活數(shù)量多。

2.5.4 酵母發(fā)酵性能的測(cè)定

酵母發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量的二氧化碳，通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中二氧化碳釋放量的測(cè)定來(lái)確定酵母的發(fā)酵性能，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，釀酒酵母單菌發(fā)酵性能最好，略高于兩種混菌發(fā)酵方式，在發(fā)酵前5 d可以觀察到瓶中有大量氣泡產(chǎn)生，二氧化碳釋放量達(dá)到106.55 g/L；兩種非釀酒酵母發(fā)酵性能較差，產(chǎn)生氣泡較少，其中檸檬形克勒克酵母單菌發(fā)酵性能最差，直致發(fā)酵結(jié)束二氧化碳釋放量才達(dá)到57.96g/L。

圖8 酵母發(fā)酵曲線Fig.8 Fermentation curves of yeasts

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)兩種非釀酒酵母耐受性、產(chǎn)酶和發(fā)酵特性的研究，發(fā)現(xiàn)東方伊薩酵母的耐受性優(yōu)于檸檬形克勒克酵母，產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力較檸檬形克勒克酵母差；三種酵母進(jìn)行單菌發(fā)酵，釀酒酵母發(fā)酵性能最好，產(chǎn)酒精能力強(qiáng)；兩種非釀酒酵母均不能單獨(dú)完成發(fā)酵，在混合發(fā)酵前期與釀酒酵母具有相互競(jìng)爭(zhēng)作用，但之后非釀酒酵母漸漸衰亡，對(duì)釀酒酵母的發(fā)酵的影響減弱，但對(duì)最終發(fā)酵酒精度幾乎沒(méi)有影響。

采用不同的接種方式將非釀酒酵母引入酒精發(fā)酵過(guò)程，在發(fā)酵結(jié)束后得到了不同風(fēng)味的果酒，其中有克勒克酵母參與發(fā)酵的柿子酒酒體具有較濃的果香味，香味物質(zhì)比較復(fù)雜，對(duì)此，后期研究可通過(guò)對(duì)發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量進(jìn)行分析，以便了解非釀酒酵母對(duì)果酒増香和品質(zhì)提升的深層次原因。