UV法或HPLC法結(jié)合金屬離子沉淀法測(cè)定米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體中主成分含量的比較Δ

魏巍，何美，王琛，李睿，李必波#，羅治彬，2（.重慶市人民醫(yī)院腫瘤血液科，重慶 000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，四川 瀘州 66000；.重慶市腫瘤研究所腫瘤防治辦公室，重慶 0000；.重慶藥友制藥有限責(zé)任公司，重慶 02）

米索硝唑是一種具有較高放射增敏比的乏氧細(xì)胞放射增敏劑，其放射增敏比為1.5[1]，最高可增至1.8～2.0[2]，常用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的放療增敏。但因其水溶性低、油水分配系數(shù)高導(dǎo)致其不良反應(yīng)發(fā)生率高，主要為外周神經(jīng)系統(tǒng)毒性（發(fā)生率為15%～28%），故而限制了其臨床應(yīng)用[3-4]。為此，本課題組將米索硝唑包裹于pH敏感脂質(zhì)體中制成米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體，以此來克服藥物的外周神經(jīng)毒性，并使其具有腫瘤靶向性[5-8]。

藥物含量測(cè)定是制劑質(zhì)量控制中非常重要的項(xiàng)目。既往米索硝唑相關(guān)檢測(cè)均采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定原藥或其代謝產(chǎn)物[9-10]，該法準(zhǔn)確、可靠，但對(duì)儀器的要求較高，且測(cè)定過程煩瑣、耗時(shí)、耗材。相比之下，紫外分光光度法（UV）操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用更低，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)檢測(cè)較為準(zhǔn)確。然而，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體中的輔料磷脂酰乙醇胺對(duì)UV法測(cè)定藥物含量的干擾大。如能通過簡(jiǎn)單的物理或化學(xué)預(yù)處理法，將脂質(zhì)體中的磷脂酰乙醇胺除去，則可為UV法的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。為此，本研究擬采用金屬離子沉淀法（以ZnCl2為金屬離子沉淀劑）預(yù)處理除去米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體中的磷脂酰乙醇胺，進(jìn)而采用UV法測(cè)定其中主成分的含量，并將結(jié)果與HPLC法比較，為實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、低廉地測(cè)定該制劑中主成分的含量提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括VWD紫外檢測(cè)器等（美國(guó)Agilent公司）；ML204型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；UV-2400PCS型紫外-可見分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3C型pH計(jì)（上海三信儀表廠）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式多用真空泵（河南予華儀器制造有限公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；SK1200H型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；ZRS-8G型智能溶出儀（天津大學(xué)無線電廠）。

1.2 藥品與試劑

米索硝唑原料藥（青島捷世康生物科技有限公司，批號(hào)：20170219，純度：≥98.5%）；米索硝唑?qū)φ掌罚绹?guó)Cayman公司，批號(hào)：15606-201610，純度：99.5%）；磷脂酰乙醇胺、膽固醇、亞油酸、維生素E、羧甲基殼聚糖（羧化度：80%）、ZnCl2均為藥用級(jí)；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法制備米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體。按處方輔料配比分別精密稱取磷脂酰乙醇胺、膽固醇、亞油酸、維生素E（比例為3∶1∶1∶0.1，m/m/m/m）各適量，置于同一100 mL圓底燒瓶中，加入10 mL氯仿使溶解，將燒瓶連接旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，在37℃、100 r/min、減壓條件下?lián)]干氯仿，得貼于燒瓶?jī)?nèi)壁一層均勻的薄膜；加入含米索硝唑的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）（藥液比為1∶9，m/m）使溶解，在50℃、100 r/min、避光條件下水化60 min，得微黃色脂質(zhì)體溶液；將上述脂質(zhì)體溶液超聲（功率：180 W，頻率：40 kHz）處理10 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，加入0.5 mL 0.3%羧甲基殼聚糖溶液，在50℃、100 r/min、避光條件下繼續(xù)水合0.5 h，即得米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體。另不加入米索硝唑，同法制備空白脂質(zhì)體。取上述空白脂質(zhì)體5 mL，按處方比例加入適量米索硝唑溶液，物理混勻，即得空白脂質(zhì)體+米索硝唑溶液。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取在五氧化二磷中干燥12 h后的米索硝唑?qū)φ掌?2.0 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成米索硝唑質(zhì)量濃度為0.48 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 輔料溶液 按處方輔料配比分別精密稱取磷脂酰乙醇胺、膽固醇、亞油酸、維生素E各適量，先以氯仿溶解，隨后加入甲醇稀釋，制成磷脂酰乙醇胺、膽固醇、亞油酸、維生素E質(zhì)量濃度分別為2.33、0.82、0.84、0.08 mg/mL的混合溶液；羧甲基殼聚糖以水溶解制成質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL的溶液。將上述2種溶液等體積混合，即得。

2.2.3 未經(jīng)預(yù)處理的空白脂質(zhì)體溶液 精密量取“2.1”項(xiàng)下空白脂質(zhì)體100 μL，加入900 μL甲醇破乳，渦旋5 min混勻，室溫靜置15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，即得。

2.2.4 經(jīng)預(yù)處理的米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液 精密量取“2.1”項(xiàng)下米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體100 μL，加入800 μL甲醇破乳，渦旋5 min混勻，加入50 mg/mL ZnCl2甲醇溶液100 μL，渦旋5 min混勻，室溫靜置15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，即得。

2.2.5 經(jīng)預(yù)處理的空白脂質(zhì)體溶液 精密量取“2.1”項(xiàng)下空白脂質(zhì)體 100 μL，加入800 μL甲醇破乳，渦旋5 min混勻，加入50 mg/mL ZnCl2甲醇溶液100 μL，渦旋5 min混勻，室溫靜置15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，即得。

2.2.6 經(jīng)預(yù)處理的空白脂質(zhì)體+米索硝唑溶液 精密量取“2.1”項(xiàng)下空白脂質(zhì)體+米索硝唑100 μL，加入800 μL甲醇破乳，渦旋5 min混勻，加入50 mg/mL ZnCl2甲醇溶液100 μL，渦旋5 min混勻，室溫靜置15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液，即得。

2.3 UV法測(cè)定脂質(zhì)體中主成分的含量

2.3.1 專屬性試驗(yàn) （1）未經(jīng)預(yù)處理樣品。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、輔料溶液、未經(jīng)預(yù)處理的空白脂質(zhì)體溶液各適量，于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，光譜圖見圖1（圖中PE為磷脂酰乙醇胺，LA為亞油酸，VE為維生素E，CHO為膽固醇，CMC為羧甲基殼聚糖）。由圖1可知，米索硝唑在322 nm波長(zhǎng)處有最大吸收；但輔料磷脂酰乙醇胺在322 nm波長(zhǎng)處也有較大吸收，即對(duì)主成分測(cè)定有很大干擾，而輔料膽固醇、亞油酸、維生素E、羧甲基殼聚糖在322 nm波長(zhǎng)處無明顯吸收，即對(duì)主成分測(cè)定無明顯干擾；未經(jīng)預(yù)處理的空白脂質(zhì)體在322 nm波長(zhǎng)處亦有較明顯的紫外吸收，即此時(shí)無法消除磷脂酰乙醇胺對(duì)主成分測(cè)定的干擾。

（2）經(jīng)預(yù)處理樣品。取“2.2”項(xiàng)下經(jīng)預(yù)處理的空白脂質(zhì)體溶液、空白脂質(zhì)體+米索硝唑溶液、米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液各適量，于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，光譜圖見圖2。由圖2A可知，經(jīng)預(yù)處理完全沉淀了輔料磷脂酰乙醇胺，空白脂質(zhì)體在322 nm波長(zhǎng)處無明顯的紫外吸收；由圖2B、C可知，米索硝唑的最大吸收峰仍出現(xiàn)在322 nm波長(zhǎng)處，因而此時(shí)輔料對(duì)主成分的測(cè)定已無干擾。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10、20、40、80、160、320 μL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列對(duì)照品溶液。以甲醇為空白，于322 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以米索硝唑質(zhì)量濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得米索硝唑回歸方程A＝0.032 8c－0.008（r＝0.999 6）。結(jié)果表明，米索硝唑檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.96～30.72 μg/mL。

圖1 未經(jīng)預(yù)處理樣品的紫外吸收光譜圖Fig 1 UV absorption spectra of untreated sample

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，分別加甲醇制成低、中、高質(zhì)量濃度（3.84、7.68、15.36 μg/mL）對(duì)照品溶液，以甲醇為空白，于322 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果，米索硝唑吸光度的RSD分別為0.93%、0.62%、0.48%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.4”項(xiàng)下經(jīng)預(yù)處理的米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液適量，分別在室溫下放置0、2、4、6、12 h時(shí)，以甲醇為空白，于322 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果，米索硝唑吸光度的RSD為0.91%（n＝5），表明經(jīng)預(yù)處理的米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體適量，共6份，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備經(jīng)預(yù)處理的米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液。以甲醇為空白，于322 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算主成分的含量。結(jié)果，米索硝唑含量平均值為99.20%，RSD為1.55%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體適量，共9份，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制成低、中、高質(zhì)量濃度的米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液。以甲醇為空白，于322 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.3.7 米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體中主成分的含量測(cè)定 取“2.1”項(xiàng)下米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體適量，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備經(jīng)預(yù)處理的米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液。以甲醇為空白，于322 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度并計(jì)算含量。平行測(cè)定3次。結(jié)果，3次測(cè)得的米索硝唑含量分別為99.86%、100.16%、100.32%（RSD＝0.56）。

圖2 經(jīng)預(yù)處理樣品的紫外吸收光譜圖Fig 2 UV absorption spectra of treated sample

表1 UV法回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests for UV（n＝9）

2.4 HPLC法測(cè)定脂質(zhì)體中主成分的含量

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：322 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.4.2 專屬性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、空白脂質(zhì)體溶液、經(jīng)預(yù)處理的米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液和經(jīng)預(yù)處理的空白脂質(zhì)體+米索硝唑溶液各適量，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖3。由圖3A可知，米索硝唑出峰時(shí)間為6.075 min；由圖3B可知，經(jīng)預(yù)處理的空白脂質(zhì)體已基本除去干擾主成分測(cè)定的輔料磷脂酰乙醇胺；由圖3C、D可知，經(jīng)預(yù)處理的空白脂質(zhì)體+米索硝唑和米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體藥物結(jié)構(gòu)及極性未受影響，主成分出峰時(shí)間一致。

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

2.4.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5、10、20、30、40、50 μL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各20 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以米索硝唑質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得米索硝唑回歸方程y＝56.82x－5.36（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，米索硝唑檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.48～4.80 μg/mL。

2.4.4 定量限與檢測(cè)限考察 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，以甲醇倍比稀釋，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比10∶1、3∶1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，米索硝唑的定量限、檢測(cè)限分別為0.23、0.08 μg/mL。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，米索硝唑峰面積的RSD為1.08%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.4”項(xiàng)下經(jīng)預(yù)處理的米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液適量，分別在室溫下放置0、2、4、6、12 h時(shí)，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，米索硝唑峰面積的RSD為1.55%（n＝5），表明經(jīng)預(yù)處理的米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體適量，共6份，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備經(jīng)預(yù)處理的米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算主成分的含量。結(jié)果，米索硝唑含量平均值為99.60%，RSD為1.38%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.8 回收率試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體適量，共9份，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制成低、中、高質(zhì)量濃度的米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 HPLC法回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests for HPLC（n＝9）

2.4.9 米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體中主成分的含量測(cè)定 取“2.1”項(xiàng)下米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體適量，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備經(jīng)預(yù)處理的米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算主成分的含量。平行測(cè)定3次。結(jié)果，3次測(cè)得的米索硝唑含量分別為99.95%、99.98%、100.05%（RSD＝0.46）。由此可見，米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體經(jīng)預(yù)處理后，采用UV法和HPLC法所測(cè)得的主成分含量之間無明顯差異。

3 討論

在對(duì)制劑進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí)，選擇合適的檢測(cè)方法是關(guān)鍵，既要準(zhǔn)確、可靠，又要方便、快捷。通常，對(duì)有紫外吸收的成分，其含量測(cè)定的首選方法是UV法或HPLC法[11]。由于2015年版《中國(guó)藥典》未收錄米索硝唑及其制劑，因此，對(duì)米索硝唑及其制劑中主成分的含量測(cè)定方法沒有現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)。

參照文獻(xiàn)[12]報(bào)道，米索硝唑的最大吸收波長(zhǎng)為320～325 nm。本試驗(yàn)通過紫外光譜掃描確定米索硝唑最大吸收波長(zhǎng)為322 nm，而其pH敏感脂質(zhì)體中的輔料磷脂酰乙醇胺在此波長(zhǎng)下有明顯干擾。磷脂分離方法包括有機(jī)溶劑萃取法、超臨界流體萃取法、乙?；?、柱層析法、膜分離法、金屬離子沉淀法等[13]，其中金屬離子沉淀法操作簡(jiǎn)單，即通過重金屬離子與磷脂酰乙醇胺結(jié)構(gòu)中的羧基或胺基強(qiáng)力結(jié)合，使其沉淀并可通過離心除去，不影響主成分的測(cè)定，更適合本研究。常用的金屬離子沉淀劑包括CoCl2、ZnCl2、NiCl2等。本課題組通過預(yù)試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，ZnCl2反應(yīng)條件溫和，不與主成分反應(yīng)，不干擾主成分的紫外吸收，更適合本研究。采用ZnCl2預(yù)處理后的脂質(zhì)體溶液中經(jīng)HPLC法分析證實(shí)已無磷脂酰乙醇胺存在，從而消除了其對(duì)主成分含量測(cè)定的干擾。

綜上所述，UV法結(jié)合金屬離子沉淀法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于米索硝唑pH敏感脂質(zhì)體中主成分的含量測(cè)定，其結(jié)果與HPLC法含量測(cè)定結(jié)果一致。