吡蟲(chóng)啉種衣劑對(duì)小麥幼苗氮代謝的影響及機(jī)制研究

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(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，鄭州 450002)

小麥苗期病蟲(chóng)害是影響小麥產(chǎn)量的主要因素。隨著種衣劑的推廣和應(yīng)用，通過(guò)種衣劑處理小麥種子來(lái)預(yù)防小麥苗期病蟲(chóng)害逐漸成為一種重要的農(nóng)業(yè)措施。研究表明，種衣劑可以提高小麥抗氧化酶活性、促進(jìn)小麥植株生長(zhǎng)、提高小麥對(duì)逆境和病蟲(chóng)害的抗性[1-2]，從而達(dá)到小麥的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。但是，種衣劑對(duì)植物產(chǎn)生的負(fù)面影響也有報(bào)道，例如烯唑醇種衣劑包衣對(duì)小麥的出苗時(shí)間和出苗率具有抑制作用[3]；戊唑醇懸浮種衣劑對(duì)小麥種子萌發(fā)的影響主要表現(xiàn)在推遲出苗時(shí)間和增加畸形植株數(shù)量[4]；三唑類(lèi)殺菌劑易引起小麥和玉米不同程度的藥害，影響作物幼苗出土、抑制幼苗生長(zhǎng)[5]等。

以吡蟲(chóng)啉(Imidacloprid)為原藥的種衣劑可以由植物根系吸收，持效期長(zhǎng)，能有效防治水稻、小麥、甜菜等作物苗期害蟲(chóng)，尤其對(duì)刺吸式口器害蟲(chóng)有特效[6]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲(chóng)啉種衣劑會(huì)推遲小麥出苗時(shí)間，而這種作用產(chǎn)生的原因可能是吡蟲(chóng)啉種衣劑影響種子吸水性和萌發(fā)相關(guān)酶活性從而推遲小麥種子萌發(fā)[7]。植物體內(nèi)的氮化物包括蛋白質(zhì)、氨基酸等，主要用于組成原生質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。在生長(zhǎng)初期，植物吸收氮的能力強(qiáng)，以氮素代謝為主，此時(shí)正是器官建成時(shí)期，需要大量的氮素供應(yīng)，以防止后期早衰。因此在植物生長(zhǎng)初期，氮素代謝對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用。關(guān)于吡蟲(chóng)啉種衣劑對(duì)植物氮代謝的影響以及這些影響產(chǎn)生的機(jī)理目前仍不清楚。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)分析吡蟲(chóng)啉種衣劑對(duì)小麥萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)階段氮代謝途徑關(guān)鍵酶活性以及酶編碼基因表達(dá)和代謝產(chǎn)物的影響，研究種衣劑對(duì)小麥初生代謝的影響，為種衣劑的安全使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

矮抗58小麥，購(gòu)自河南秋實(shí)種業(yè)科技股份有限公司；600 g/L 吡蟲(chóng)啉懸浮種衣劑，江蘇龍燈化學(xué)有限公司產(chǎn)品，購(gòu)自鄭州市農(nóng)藥市場(chǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 拌種處理

吡蟲(chóng)啉懸浮種衣劑分別設(shè)置6.67，13.34 g/kg制劑種子2個(gè)濃度梯度(下文中分別以吡蟲(chóng)啉1.0×和吡蟲(chóng)啉2.0×表示)，分別取6.67 g和13.34 g吡蟲(chóng)啉種衣劑，加適量清水稀釋后對(duì)1 kg矮抗58小麥種子進(jìn)行拌種，清水拌種作為空白對(duì)照[7]。為了防止種衣劑脫落，種衣劑拌種后的種子在陰涼處晾干后再進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)[8]。

1.2.2 萌發(fā)試驗(yàn)

選取不同濃度吡蟲(chóng)啉包衣小麥種子各25粒置于墊有3層濾紙的加水培養(yǎng)皿中，每處理各3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含3個(gè)培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中[(20±1)℃，每日光照16 h，黑暗8 h]培養(yǎng)發(fā)芽，每天在同一時(shí)間補(bǔ)充相同量的水分，分別在種子萌發(fā)第3、6、9、12、15天時(shí)隨機(jī)取樣，樣品保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 氮代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量測(cè)定

根據(jù)NCBI已公布的基因序列，設(shè)計(jì)用于PCR反應(yīng)的小麥氮代謝相關(guān)酶基因引物序列(表1)。采用Trizol法提取樣品RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD值后，用兩步法反轉(zhuǎn)錄得到模板cDNA，梯度PCR測(cè)定引物的最適退火溫度，再以Actin為目的基因，SYBR?green I 為熒光染料進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，總體系12μL(SYBR?green I 6μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、稀釋5倍的模板cDNA 1μL和雙蒸水4μL)，2-ΔΔC(t)法計(jì)算結(jié)果。

表1 氮代謝相關(guān)酶基因的引物

基因酶參考序列引物序列NR硝酸還原酶X57844.1F:gctgatgcaccacggcttcaR:gggaaaccgttggcaagctcNiR亞硝酸還原酶FJ527909F:attattcgccgtcgtcgtcR:atatgccgccctccgtgaagGS谷氨酰胺合成酶JF894116.1F:gcccttcaccgacaagatcaR:atggcctgtgggtatagaaGOGAT谷氨酸合成酶KF521800F:cgacatcttagcagaacgtggagR:ccatcaccggagtcgttgGDH谷氨酸脫氫酶HQ821868F:gagtgcacaattccgaaagR:gaatattggccacggctgACTINAB181991.1F:tggcatcacacgttctacaacR:gcctggattgcgacata

1.2.4 氮代謝相關(guān)酶活性測(cè)定

1) 硝酸還原酶(Nitrate reductase，NR)活性測(cè)定：參考高俊鳳[9]的方法。樣品加入提取緩沖液及少量石英砂冰浴中研磨勻漿，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，所得上清液即為粗酶提取液。取粗酶液0.2 mL，加入0.3 mL 2 mg/mL NADH溶液和0.5 mL 0.1 mol/L KNO3溶液混勻， 25 ℃保溫30 min，以1 mL 30%三氯乙酸作為對(duì)照。保溫結(jié)束后加入1 mL 30%三氯乙酸搖勻以終止反應(yīng)，加入2 mL 0.2% a-萘胺溶液，2 mL 1%磺胺溶液，搖勻靜置顯色15 min，測(cè)定反應(yīng)液在520 nm的吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算反應(yīng)液中所產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量[10]。

2) 亞硝酸還原酶(Nitrite reductase，NiR)活性測(cè)定：參考Scheible W R等[11]的方法。反應(yīng)液(1.35 mL)包括：0.05 mL 10 mmol的亞硝酸鈉溶液、1 mL pH=7.5的100 mmol磷酸鈉緩沖液、0.05 mL甲基紫精溶液、蒸餾水0.05 mL，最后加酶提取物0.15 mL。反應(yīng)液中加入0.05 mL連二亞硫酸鈉鹽(50 mg/mL)后在25 ℃下反應(yīng)30 min。取0.2 mL反應(yīng)液加蒸餾水稀釋至6.7 mL，加入1%(w/v)鹽酸萘乙二胺1.5 mL和1.8 mL 1%磺胺。15 min后，測(cè)定反應(yīng)液在540 nm處吸光率。

3) 谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)活性測(cè)定：提取緩沖液：0.05 mol/L Tris-HCl，pH=8.0，含2 mmol/L DTT、2 mmol/L MgSO4、0.4 mol/L蔗糖；反應(yīng)混合液A：0.1 mol/L pH=7.4 Tris-HCl緩沖液，含20 mmol/L谷氨酸鈉鹽，80 mmol/L Mg2+，20 mmol/L半胱氨酸和2 mmol/L EGTA；反應(yīng)混合液B(含鹽酸羥胺，pH=7.4)：反應(yīng)混合液A再加入80 mmol/L鹽酸羥胺；顯色劑：0.2 mol/L TCA，0.37 mol/L FeCl3和0.6 mol/L HCl的混合液；40 mmol/L ATP溶液(臨用前配制)。樣品冰浴中加入提取緩沖液研磨勻漿，4 ℃，15 000 g離心20 min，所得上清液為粗酶液。取0.7 mL粗酶液加入1.6 mL反應(yīng)混合液B和0.7 mL ATP溶液混勻，并置于37 ℃下保溫。30 min后加入1 mL顯色劑搖勻，5 000 g下離心10 min，取上清液測(cè)定其在540 nm處的吸光值。以加入1.6 mL反應(yīng)混合液A的溶液作為對(duì)照[12]。

4) 谷氨酸合成酶(Glutamate synthase，GOGAT)活性測(cè)定：提取液配制以及粗酶液提取方法采用上述GS酶活性測(cè)定中的方法進(jìn)行。反應(yīng)混合液含0.4 mL 20 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mL 10 mmol/L的KCl、0.5 mL 20 mmol/L a-酮戊二酸、0.2 mL 3 mmol/L NADH和0.3 mL粗酶液，用25 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=7.6)補(bǔ)足1.5 mL。于340 nm處每隔30 s測(cè)定反應(yīng)液消光值，取光密度穩(wěn)定減小的一段來(lái)衡量酶活性[13]。

5) 谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase，GDH)活性測(cè)定：提取液為0.2 mmol/L Tris-HCl(pH=8.2)；反應(yīng)液A：1.6μmol/L NAD+360μmol/L Tris-HCl(pH=9.0)；反應(yīng)液B：1.6μmol/L NAD+60μmol/L L-谷氨酸+360μmol/L Tris-HCl(pH=9.0)。植物材料冰浴中加入提取液研磨勻漿，取1 mL酶提取液加入2 mL反應(yīng)液B，以反應(yīng)液A為對(duì)照，反應(yīng)溶液在340 nm處比色，每隔30 s記錄一次消光值，直至讀數(shù)穩(wěn)定[14]。

1.2.5 氮代謝物質(zhì)含量測(cè)定

可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法[15]；游離氨基酸總量測(cè)定：采用茚三酮顯色法[16]。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析和處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2010軟件進(jìn)行處理，用SPSS 19.0軟件方差分析和相關(guān)性分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種衣劑對(duì)氮代謝酶編碼基因表達(dá)的影響

選擇植物氮代謝途徑中的關(guān)鍵酶：硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫氫酶(GDH)為研究對(duì)象，首先利用熒光定量PCR法分析種衣劑處理后氮代謝途徑關(guān)鍵酶編碼基因的表達(dá)變化，研究種衣劑對(duì)氮代謝途徑酶編碼基因表達(dá)的影響。結(jié)果(圖1)顯示：高濃度的吡蟲(chóng)啉處理后小麥植株中氮代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量均顯著下降；而低濃度的吡蟲(chóng)啉處理后NR基因表達(dá)量除了小麥萌發(fā)第9天明顯提高，其余時(shí)期降低。結(jié)果說(shuō)明吡蟲(chóng)啉種衣劑會(huì)降低氮代謝途徑關(guān)鍵酶的基因的表達(dá)量，而且這種抑制作用和種衣劑的使用濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

注：“*”和“**”分別表示差異顯著(p<0.05)和極顯著(p<0.01)。下同。圖1 吡蟲(chóng)啉對(duì)小麥氮代謝基因表達(dá)量的影響

圖2 吡蟲(chóng)啉對(duì)小麥氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

圖3 吡蟲(chóng)啉包衣對(duì)小麥氮代謝產(chǎn)物含量的影響

2.2 種衣劑對(duì)氮代謝酶活性的影響

在確定吡蟲(chóng)啉種衣劑影響植株氮代謝基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，采用生理生化方法測(cè)定了硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫氫酶(GDH)活性。結(jié)果(圖2)顯示：低濃度吡蟲(chóng)啉種衣劑處理后NR和GS酶活性增加，而NiR、GOGAT和GDH酶活性降低，高劑量吡蟲(chóng)啉種衣劑處理后NR、NiR和GDH酶活性降低；而GS和GOGAT酶活性反而增加。從結(jié)果看出，不同濃度種衣劑對(duì)氮代謝酶活性的影響不同，不同酶活性對(duì)種衣劑的相應(yīng)也不相同。

2.3 種衣劑對(duì)氮代謝產(chǎn)物的影響

為了揭示種衣劑對(duì)氮代謝水平的影響，分析了種衣劑對(duì)植物氮代謝產(chǎn)物：游離氨基酸含量和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。從圖3可看出，吡蟲(chóng)啉種衣劑處理后小麥植株中可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量顯著增加，而且隨著與種衣劑的使用濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

氮代謝是植物生命活動(dòng)中最基本的代謝體系之一，主要作用包括無(wú)機(jī)氮的同化、還原以及含氮有機(jī)化合物的合成、轉(zhuǎn)化等。植物生長(zhǎng)初期，正是器官建成時(shí)期，吸收氮的能力強(qiáng)，以氮素代謝為主。因此研究種衣劑對(duì)植物幼苗生長(zhǎng)時(shí)期氮代謝的影響可以揭示種衣劑對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育影響的生理基礎(chǔ)，具有重要的意義。前期研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲(chóng)啉種衣劑可推遲小麥種子萌發(fā)，影響小麥幼苗生長(zhǎng)[7]。因此，本研究擬研究吡蟲(chóng)啉種衣劑對(duì)小麥氮代謝的影響，揭示吡蟲(chóng)啉種衣劑對(duì)小麥影響產(chǎn)生的生理機(jī)制。

植物體內(nèi)NR和NiR分別催化NO3-還原為NO2-和NO2-還原為NH4+，最終NH4+參與到蛋白質(zhì)的合成。NR和NiR酶是氮代謝的關(guān)鍵酶，其活性的調(diào)控在氮同化控制中起著重要作用，并顯著影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲(chóng)啉種衣劑處理后，小麥植株中亞NiR基因表達(dá)和酶活性均顯著下降。谷氨酰胺合成酶(GS)是氮代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，能催化NH4+和谷氨酸合成谷氨酰胺，是高等植物氮素同化的主要途徑[18]，過(guò)量的NH4+對(duì)植物機(jī)體有毒害作用，而GS活性增強(qiáng)可以促進(jìn)銨態(tài)氮與谷氨酸合成谷氨酰胺，進(jìn)一步合成谷氨酸，使NH4+同化加強(qiáng)，是植物的一種自我保護(hù)機(jī)制[19-20]。結(jié)果顯示，處理后GS基因表達(dá)下降，但是催化活性卻顯著增加，可能是在種衣劑處理下，需要加速氮代謝，從而加強(qiáng)植物的自我保護(hù)。同時(shí)，GDH活性呈增加趨勢(shì)，可以促進(jìn)NH4與a-酮戊二酸轉(zhuǎn)化成谷氨酸，有助于氮代謝的進(jìn)行[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，種衣劑處理后，植株中GDH基因表達(dá)量和酶活性均顯著降低。

游離氨基酸在植物細(xì)胞中以游離態(tài)存在，可被合成氨基酸和蛋白質(zhì)，是植物氮運(yùn)輸?shù)闹饕问絒22]。用游離氨基酸含量可部分反映氮轉(zhuǎn)化的生理變化，游離氨基酸含量減少，可促使氮的轉(zhuǎn)化向蛋白質(zhì)合成的方向發(fā)展[19]?？扇苄缘鞍资切←湹锢鄯e的主要形式和最終產(chǎn)物，因此在同化物代謝的過(guò)程中起著重要作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲(chóng)啉種衣劑處理后，小麥植株中游離氨基酸和可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著增加，而且呈現(xiàn)出濃度效應(yīng)。說(shuō)明吡蟲(chóng)啉種衣劑處理后，小麥植株中氮代謝加快，氮素消耗加速，如果不及時(shí)補(bǔ)充氮源，則會(huì)影響小麥的生長(zhǎng)和發(fā)育。