兔巴氏桿菌油佐劑疫苗制備與免疫效果分析

劉曼 李明勇 劉照波 張志全 王召朋

（青島康大食品有限公司 264000）

兔巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種人畜共患病，又稱兔出血性敗血病，臨診特征是鼻炎、地方流行性肺炎、全身性敗血癥、中耳炎、結(jié)膜炎、子宮積膿、睪丸炎等不同病型。特別以季節(jié)變化、潮濕、悶熱、通風(fēng)不良、飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)雀鞣N不良應(yīng)激容易引起家兔發(fā)病和死亡。

2018年5月下旬以來，山東省青島地區(qū)部分兔場在斷奶前后出現(xiàn)大量死亡，表現(xiàn)為種兔張口仰脖喘氣、流涎，死亡率高，剖檢胸腔及心包積液，腺腫大充血，肺嚴(yán)重化膿性壞死，肺臟解剖面散布白色膿包，內(nèi)含奶油狀內(nèi)容物，肝臟邊緣發(fā)黑變性。

由于巴氏桿菌病血清型眾多，且各血清型之間的交叉免疫保護(hù)作用較小，商品疫苗對本地流行菌株的保護(hù)效果不理想。因此，本試驗(yàn)利用本地區(qū)分離的巴氏桿菌3：A、6：A菌株制備自家滅活苗，觀察對兔的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 儀器及材料

1.1.1 菌種

兔多殺性巴氏桿菌3：A、6：A菌株 (青島易邦生物工程有限公司分離鑒定，3：A對家兔的致死劑量為8～10cfu/ml，6：A菌株最小致死量為50cfu/ml)。

1.1.2 試驗(yàn)動物

35日齡清潔級大耳白兔30只 （青島康大生物科技有限公司提供）。35日齡斷奶商品兔2000只 （養(yǎng)殖戶提供）。

1.1.3 主要試劑

細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、麥康凱瓊脂粉、血瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂、改良馬丁培養(yǎng)基等，均購于北京路橋技術(shù)股份有限公司；白油由深圳中潤通化工有限公司生產(chǎn)；甲醛由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌購于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，恒溫振蕩培養(yǎng)箱購于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，數(shù)顯隔水式不銹鋼電熱恒溫培養(yǎng)箱購于上海無錫沃信儀器有限公司；醫(yī)用型超凈工作臺購于上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

1.2 巴氏桿菌疫苗懸液的制備

將從病料中分離篩選出的菌株3：A、6：A分別接種于血液瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18h后，分別轉(zhuǎn)接于馬丁肉湯培養(yǎng)基中（1.0%血清含，0.1%血紅素），37℃振蕩培養(yǎng)18～24h，進(jìn)行純度檢查合格后作為種子液。按照10%的比例將種子液再次接種于馬丁肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)24h，收集菌液，確保菌含量達(dá)到2.5×1010CFU/ml。

1.3 菌液的滅活

在制備好的菌液中加入甲醛溶液，使其終濃度為0.35%，37℃滅活24～48h。將這杯好的滅活菌液接種于血瓊脂平板進(jìn)行無菌試驗(yàn)，37℃培養(yǎng)24～48h，如血瓊脂平板無細(xì)菌生長，說明菌液已完全滅活。

1.4 疫苗的制備

滅活后菌的液加入2%吐溫-80完全溶解。同時按照白油92%、Span-80 6%、硬脂酸鋁2%的比例均勻混合油相，高壓滅菌后自然冷卻至室溫。將油相與滅活后的菌液按3：1的比例混合，充分混勻，乳化備用。

1.5 疫苗質(zhì)量檢驗(yàn)

1.5.1 無菌檢驗(yàn)

取制備好的疫苗接種于血瓊脂平板，檢查是否有細(xì)菌生長。

鑒于干擾信號產(chǎn)生的原因錯綜復(fù)雜，且具有很大的隨機(jī)性，單純的硬件抗干擾措施很難保證信號傳輸、接收完全不受干擾，因此設(shè)計(jì)了必要的軟件抗干擾措施。

1.5.2 粘度檢驗(yàn)

用移液管吸取疫苗1ml，觀察自然流出時間。

1.5.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

采用3000r/min離心15min的離心加速分層法，觀察液體分層情況。

1.5.4 疫苗的免疫效果檢驗(yàn)

將30只清潔級試驗(yàn)兔隨機(jī)分成3組，每組10只，第一組皮下接種疫苗0.5ml/只，第2組皮下接種1ml/只；第3組作為對照，不接種。接種14d后，每組試驗(yàn)兔肌肉注射致死量強(qiáng)毒菌液。觀察各組的發(fā)病率、死亡率及剖檢病死兔，觀察病理變化。

1.6 疫苗的中試試驗(yàn)

35日齡斷奶商品兔2000只，分兩組，每組各1000只，試驗(yàn)組皮下接種1ml/只巴氏桿菌疫苗，空白對照不接種。記錄70日齡出欄成活率。對死亡兔進(jìn)行解剖和臨床癥狀的記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗質(zhì)量檢驗(yàn)分析

滅活苗接種于血瓊脂平板無細(xì)菌生長，表明無菌檢驗(yàn)合格，滅活效果良好。

附表 滅活苗效率檢驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 粘度檢驗(yàn)

用移液管吸取疫苗1ml，自然流出所需時間約5s，符合油佐劑疫苗的粘度要求 (4～6s)。

2.1.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

將疫苗滴于蒸餾水中，疫苗不擴(kuò)散，且3000r/min離心15min后無分層，表明疫苗的穩(wěn)定性良好。

2.1.4 疫苗效力檢驗(yàn)

如附表所示為效力檢驗(yàn)結(jié)果。對照組未接種疫苗，攻毒后全部發(fā)病，全部死亡。剖檢病死兔，表現(xiàn)為典型的巴氏桿菌病變特征。試驗(yàn)組1，接種0.5ml疫苗，10只兔發(fā)病4只，死亡2只，發(fā)病率和死亡率分別為40%和20%；試驗(yàn)組2接種1ml疫苗，無發(fā)病和死亡，表明注射該疫苗1ml時，免疫效果最好。

2.2 疫苗的中試試驗(yàn)

中試試驗(yàn)結(jié)果：對照組未接種疫苗1000只兔，出欄存活775只，死亡225只，出欄成活率77.50%，而接種疫苗的試驗(yàn)組，死亡111只，出欄存活889只，出欄成活率達(dá)88.90%。分別對對照組和試驗(yàn)組的病死兔進(jìn)行剖檢和死亡原因分析。試驗(yàn)組死亡111只，呼吸道疾病死亡為11只，占死亡數(shù)的9.9%，腹瀉發(fā)病79只，占死亡數(shù)的71%，其他死亡原因的21只，占死亡總數(shù)的18.91%。對照組死亡225只，呼吸道疾病死亡108只，占死亡總數(shù)的48%，腹瀉死亡89只，占死亡總數(shù)比例39.55%，其他死亡28只，占死亡總數(shù)比例12.44%。數(shù)據(jù)表明，疫苗對兔群具有一定的保護(hù)作用。

3 討論

本試驗(yàn)利用兔場分離的巴氏桿菌不同血清型的菌株，挑選致病力強(qiáng)的3：A和6：A血清型的菌株制備的兔巴氏桿菌油佐劑滅活疫苗，經(jīng)無菌試驗(yàn)、安全試驗(yàn)檢驗(yàn)合格后，經(jīng)免疫試驗(yàn)證明疫苗免疫劑量為1ml時，免疫效果最好。中試試驗(yàn)結(jié)果表明，該疫苗起到了良好的保護(hù)作用，大大提高了商品兔的出欄成活率。對病死兔的死亡原因進(jìn)行記錄和剖檢，試驗(yàn)組呼吸道疾病死亡11只，而對照組呼吸道疾病死亡108只，腹瀉和其他死亡原因比例相差不大，證明該疫苗對巴氏桿菌病具有一定防治作用。

在對照組的死亡兔中分離到了3：A和6：A血清型的巴氏桿菌，而試驗(yàn)組中未分離到3：A和6：A血清型巴氏桿菌，僅分離到了3：F血清型巴氏桿菌，證明3：A和6：A型自家苗具有良好的免疫效果，對臨床的發(fā)病具有良好的控制作用。