酶聯(lián)免疫吸附試驗法的自配陰性質(zhì)控物的均勻性和穩(wěn)定性評價

岑偉明，梁越媚，梁寶環(huán)，黃明蘭，黃媛萍，方鳳媚，隋洪

(東莞康華醫(yī)院，廣東 東莞 523080)

作為臨床診療工作的核心，檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性對臨床醫(yī)生的診療效果起著至關(guān)重要的作用。想要獲得高質(zhì)量的檢驗結(jié)果，必須使用安全方便、性能可靠的室內(nèi)質(zhì)控物[1]，最終才能夠有效確保檢驗結(jié)果正確可靠[2]。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法的影響因素眾多[3]，常見的有標(biāo)本狀態(tài)、實驗溫度濕度、孵育時間、顯色時間等等，為了保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要使用質(zhì)控物進行室內(nèi)質(zhì)量控制進行監(jiān)測和控制[4]。在醫(yī)院等級評審條款中規(guī)定血清學(xué)檢測時須同時進行已知滴度的血清陽性質(zhì)控與陰性質(zhì)控。而在ISO15189：2012質(zhì)量體系中，針對定性試驗，明確規(guī)定必須選擇濃度值為臨界值2～4倍左右的弱陽性及濃度值為臨界值0.5倍左右的陰性質(zhì)控物進行室內(nèi)質(zhì)控監(jiān)測。弱陽性質(zhì)控物已經(jīng)有較成熟的第三方商業(yè)質(zhì)控物，但陰性質(zhì)控物由于要求嚴(yán)格，且不同廠家的試劑盒的臨界值濃度不一，需求的陰性質(zhì)控物濃度也不一致，導(dǎo)致目前市面上暫無類似的質(zhì)控物可供選擇。故在保證實驗結(jié)果的有效性的前提下，本室采用自行配制方案來配制乙肝表面抗原（HBsAg）、人免疫缺陷病毒抗體（HIV）、梅毒特異性抗體（TP）、丙肝病毒抗體（HCV）四個項目的陰性質(zhì)控物，具體配制方法及評價方案如下：

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料 國產(chǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測HBsAg、HIV、TP、HCV 試劑盒，合共 4 種試劑盒，除HIV試劑盒為北京萬泰公司提供外，其余3種試劑均為英科新創(chuàng)公司提供。上述試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均按說明書要求保存，在有效期內(nèi)使用。

1.1.2 檢測儀器 TECAN SUNRISE酶標(biāo)儀、上海一恒電熱恒溫水箱、匯松全自動酶標(biāo)洗板機PW-960。所有儀器均按ISO15189質(zhì)量體系要求進行校準(zhǔn)。

1.2 配制方案

1.2.1 血清基質(zhì)的制備 收集正常人血清 (乙肝兩對半及HIV、HCV、TP均陰性且無溶血或脂血)500 ml，混勻后以 3500～4500r/min 離心 10min，去除殘留的纖維蛋白和血細(xì)胞成份，56℃加熱30min滅活后制得質(zhì)控物血清基質(zhì)。

1.2.2 稀釋度的確定 用上述血清對項目的檢測試劑盒內(nèi)自帶的陽性對照品做5～320倍系列倍比稀釋，測定抗體的滴度和各稀釋度的質(zhì)控物吸光度值，每稀釋度平行做3孔，取其平均值。HBsAg、Anti-HIV、Anti-TP、HCV-Ab 取樣本/臨界值 （S/CO）在0.3-0.7范圍的稀釋度作為外部質(zhì)控血清的最終稀釋倍數(shù)。

1.2.3 配制及保存 根據(jù)確定的稀釋度用制備的血清基質(zhì)稀釋各個項目陽性對照品至目標(biāo)濃度的質(zhì)控物。將質(zhì)控血清用0.12mm濾膜過濾除菌，按每天試驗用量分裝、標(biāo)記、封口，-70℃以下保存。

1.3 均勻性評價 根據(jù)CNAS-GL03文件中均勻性評價的單因子方差分析方案來設(shè)計評價方案：在配制好的質(zhì)控物中隨機抽取m=10個樣品，每個樣品重復(fù)測定n=2次，測試總次數(shù)為N=20次，自由度 f1=m-1=9、f2=N-m=10，以 C1-1、C1-2、C2-1、C2-2、……C10-1、C10-2表示每個測試的S/CO值，按下列步驟進行統(tǒng)計分析：

1.3.1 每個樣品的2次測試的平均值X1=(C1-1+C1-2)/2、X2=(C2-1+C2-2)/2、……X10=(C10-1+C10-2)/2；

1.3.2 全部樣品測試的總平均值X均=(X1+X2+……+X10)/10；

1.3.3 樣品內(nèi)平方和SS1=(X1-X均)2+(X2-X均)2+……+(X10-X均)2，樣品內(nèi)均方 MS1=SS1/f1；

1.3.4 樣品間平方和SS2=(C1-1-X1)2+(C1-2-X1)2+(C2-1-X2)2+(C2-2-X2)2+……+(C10-1-X10)2+(C10-2-X10)2，樣品間均方MS2=SS2/f2；

1.3.5 統(tǒng)計量F=MS1/MS2；

1.3.6 在當(dāng)前實驗條件下，F(xiàn)臨界值為自由度為(f1，f2)及給定顯著性水平α（通常α=0.05）的臨界值Fα（f1，f2）即 F0.05（9，10），查表結(jié)果為 3.02；

1.3.7 若F小于F0.05（9，10）則表明樣品內(nèi)和樣品間無顯著性差異，樣品是均勻的。

1.4 穩(wěn)定性評價 將制備的質(zhì)控物樣品在-70℃冰箱分別保存1、2、3…12個月，每日每測定批次取一個樣品解凍后當(dāng)天使用，每份樣品測定1孔，以月份為單位收集數(shù)據(jù)，求得每月的平均S/CO值，要求該值小于1.00，即結(jié)果需保持為陰性。

1.5 結(jié)果統(tǒng)計 所有的結(jié)果統(tǒng)計均通過EXCEL完成。

2 結(jié)果

2.1 稀釋度的測定結(jié)果 根據(jù)上述稀釋度用制備的血清基質(zhì)稀釋各個項目陽性對照品至目標(biāo)濃度的質(zhì)控物，按每日用量分裝并于-70℃保存?zhèn)溆?。見?。

表1 各項目的稀釋測定結(jié)果

2.2 均勻性評價 評價結(jié)果見表2及表3。由結(jié)果可知四個項目的 F 值均小于 F0.05（9，10）值 3.02，表明其均勻性無顯著性差異。

2.3 穩(wěn)定性評價 結(jié)果見表3，可知四個項目的在12個月中的S/CO月均值均小于1.00，說明穩(wěn)定性可以接受。

3 討論

在臨床實驗室中，質(zhì)控物是保證室內(nèi)質(zhì)量控制工作的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。但是目前臨床實驗室免疫定性分析使用的質(zhì)控物存在項目單一且價格昂貴、訂購不方便等缺點，很多醫(yī)院同仁為尋求解決方法，開始自配質(zhì)控物。王開軍等[6]配制出糖化血紅蛋白的質(zhì)控物，效果穩(wěn)定可靠；董莉等[7]通過收集血清配制出穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光法定量質(zhì)控物，其穩(wěn)定性，精密度等符合使用要求。定性項目方面，有多篇文獻報道通過制備定性項目室內(nèi)質(zhì)控物，可以對定性項目的室內(nèi)質(zhì)控起到監(jiān)控作用，實用價值良好[8-11]。綜上所述，在當(dāng)前商業(yè)質(zhì)控品不足的情況下，要解決實驗室的質(zhì)控控制全面監(jiān)控問題，自配質(zhì)控物可以起到很好的補充作用。室內(nèi)質(zhì)控物的性能包括：基質(zhì)、穩(wěn)定性、瓶間差、分析物水平及預(yù)處理的要求等，與室內(nèi)質(zhì)量控制運行有效性密切相關(guān)，CNAS-CL39《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)定性檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明》文件（下稱CNAS-CL39文件）對自配質(zhì)控物的評價要求至少應(yīng)包括均勻性及穩(wěn)定性評價[12]。

表2 均勻性評價結(jié)果

表3 穩(wěn)定性評價結(jié)果

對于自配陰性質(zhì)控物的均勻性，本文參考了CNAS-GL03：2006《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》（下稱CNAS-GL03文件）中的單因子方差分析方案來進行評價，結(jié)果顯示四個項目的陰性質(zhì)控物的F值均小于規(guī)定的Fa（f1，f2）值，表明其樣品內(nèi)和樣品間無顯著性差異，質(zhì)控物是均勻的。

另一個評價質(zhì)控物質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)是穩(wěn)定性[13，14]。由于試劑批間差、板間差和操作誤差等不確定的因素存在，導(dǎo)致ELISA試驗的精密度較高，有研究指出，手工實驗操作下，樣本吸光度值越低，CV值就越大，當(dāng)S/CO值處于0.92至1.51的范圍下，CV值可高達26%[15]。而本文四個項目為陰性質(zhì)控物，由于其S/CO均值僅為0.4左右，在剔除失控數(shù)據(jù)后，統(tǒng)計年度累積CV值分別為HBsAg-45.23%、HCV-46.51%、HIV-50.01%、TP-48.53%。CNAS-GL03文件中的穩(wěn)定性評價方案，要求其測試方法必須是“精密而靈敏的”，故此方案并不適合評價精密度較低的ELISA定性試驗，而目前國內(nèi)暫無適用的評價免疫定性試驗自配室內(nèi)質(zhì)控物的穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)文件。ELISA定性試驗的報告方法僅有兩種，有反應(yīng)性（陽性）或無反應(yīng)性（陰性），在CNAS-CL39文件中，有規(guī)定定性試驗的質(zhì)控判定規(guī)則可以采用肉眼判斷結(jié)果規(guī)則，即陰、陽性質(zhì)控物的檢測結(jié)果分別為陰性和陽性即表明在控。故據(jù)此筆者認(rèn)為針對手工操作的定性試驗，其質(zhì)控物的穩(wěn)定性評價也僅須符合上述規(guī)則即可?？v觀四個項目一年的質(zhì)控數(shù)據(jù)，其S/CO平均值均小于1.00，表明在12個月期間，仍能保持陰性的結(jié)果，是穩(wěn)定的。

綜上所述，HBsAg、HIV、TP、HCV 四個項目的陰性質(zhì)控物的均勻性和穩(wěn)定性均符合實驗室要求，可以應(yīng)用于臨床實驗的質(zhì)量控制當(dāng)中，保證實驗室結(jié)果準(zhǔn)確。

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