EV71感染HFMD患兒中的細胞、體液及免疫因子水平變化分析

郭衛(wèi)軍

(鶴煤總醫(yī)院檢驗科，河南 鶴壁 458000)

手足口病(Hand foot and mouth disease，HFMD)是臨床常見的一種傳染性疾病，是由腸道病毒誘發(fā)的急性傳染病，其中常見感染病原體為腸道病毒71型 （enterovirus 71，EV71）、 柯薩奇病毒A16型，常發(fā)生于5歲以下的嬰幼兒，以發(fā)熱與手、足、口等部位的皮疹潰瘍?yōu)橹饕R床表現(xiàn)[1]。EV71具有高度嗜神經性，起病急、進展快，患者臨床表現(xiàn)程度具有差異性，病情輕者只會出現(xiàn)皮疹，重癥患者常合并腦膜炎、肺水腫、心肌炎、呼吸循環(huán)衰竭等嚴重并發(fā)癥，對患者的生命安全造成嚴重影響。臨床發(fā)現(xiàn)[2]，手足口疾病的發(fā)病機制除了與病原體感染相關外，還與患者機體免疫機制存在密切聯(lián)系。本研究對我院收治的82例HFMD患兒與30例健康兒童檢測細胞免疫學指標、體液免疫學指標，并分析其在手足口疾病發(fā)展中的作用，為臨床免疫支持提供實驗依據(jù)，為臨床治療提供基礎性資料。

1 研究對象及方法

1.1 納入排除標準

1.2.1 納入標準 ⑴HFMD患兒的診斷及病情分級標準參考衛(wèi)生部2010年公布的《手足口病診治指南》中的標準[3]；⑵患兒常見臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、手足口部皮疹及潰瘍，重癥患兒可表現(xiàn)為肌痙攣、腦炎、肺水腫、心肺衰竭等；⑶本研究獲得患兒家長的知情同意。

1.2.2 排除標準 ⑴患兒病情未經過實驗室確診；⑵合并先心病、急慢性全身性感染性疾病的患兒；⑶具有免疫缺陷性疾病的患兒。

1.2 研究對象 選取本院2012年2月－2015年12月收治的82例HFMD患兒進行研究，根據(jù)《手足口病診治指南》中的標準分為輕癥組61例、重癥組21例，另選30例健康兒童作為對照組。

輕癥組61例，男34例、女27例，年齡1～3歲，平均（2.0±0.5）歲。 重癥組 21 例，男 12 例、女 9例，年齡 1～3 歲，平均（1.8±0.6）歲。 對照組 30 例患者，男 16 例、女 14 例，年齡 1～3 歲，平均（2.1±0.6）歲。三組對象的年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.3 觀察指標及檢測方法 對比三組的細胞免疫指標：CD3+、CD4+、CD8+、自然殺傷細胞（NK）；對比三組的體液免疫指標：免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白 G（IgG）、免疫球蛋白 M（IgM）、補體 C3、C4；細胞因子水平：白細胞介素－6（IL－6）、白細胞介素－10（IL－10）、腫瘤壞死因子 α（TNF－α）的差異。

所有患者確診后24h內接受相關檢查，清晨八點空腹抽取3ml肘靜脈血，進行10min離心后提取血清，置入－20℃保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)中雙抗體夾心法測定白細胞介素－6（IL－6）、白細胞介素－10（IL－10）、腫瘤壞死因子 α（TNF－α）等細胞因子；采用日立全自動7080生化分析儀測定免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白 M（IgM）、補體 C3、C4 等體液免疫指標水平；采用Facscalibur型流式細胞儀測定CD3+、CD4+、CD8+等細胞免疫指標水平， 試劑盒均購自北京邦定生物醫(yī)學公司。

1.4 治療方法 輕癥者使用西瓜霜噴劑 （批準文號：國藥準字Z45021599，生產企業(yè)：桂林三金藥業(yè)股份有限公司），1～2g/次，3 次/d。 重癥者在使用西瓜霜噴劑基礎上口服利巴韋林顆粒（批準文號：國藥準字H51023510，生產企業(yè)：四川百利藥業(yè)有限責任公司），10～15mg/kg/d。

1.5 統(tǒng)計學方法 正態(tài)分布的計量指標采用均數(shù)±標準差（±s）進行描述，三組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；統(tǒng)計軟件采用SAS9.1。

2 結果

2.1 三組細胞免疫水平比較 重癥組、輕癥組的CD3+、CD4+、NK 細胞比例均顯著的低于對照組（P＜0.05），CD8+細胞比例顯著的高于對照組（P＜0.05）；重癥組的CD3+、CD4+、NK細胞比例均顯著的低于輕癥組（P＜0.05），CD8+細胞比例顯著的高于輕癥組（P＜0.05）；（表 1）。

表1 組細胞免疫水平比較（±s）

表1 組細胞免疫水平比較（±s）

注：與對照組比較 *P＜0.05，與重癥組比較 #P＜0.05。

4.3±1.1*2.7±0.8*5.4±1.2 1 6.2 0 4＜0.0 0 1組別輕癥組重癥組對照組F值P值n 6 1 2 1 3 0 C D 3+（%） C D 4+（%） C D 8+（%） N K（%）5 7.2±7.4*#3 8.6±8.0*6 8.5±8.3 1 9.4 7 1＜0.0 0 1 2 7.4±5.3*#1 6.9±5.8*3 5.1±6.4 1 3.2 8 6 0.0 0 2 2 9.3±6.1*#3 4.0±5.3*2 5.2±5.7 8.9 6 1 0.0 2 8

2.2 體液免疫指標比較 重癥組、輕癥組患兒與對照組的IgA水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；重癥組、輕癥組的IgG、IgM顯著的高于對照組（P＜0.05），C3、C4 均顯著的低于對照組（P＜0.05）；重癥組、 輕癥組的 IgA、IgG、IgM、C3、C4差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；（表 2）。

2.3 三組細胞因子比較 重癥組、輕癥組的IL－6、IL－10、TNF－α 顯著的高于對照組（P＜0.05）；重癥組IL－6、IL－10、TNF－α 顯著的高于輕癥組 （P＜0.05）；（表 3）。

表2 體液免疫指標比較（±s）

注：與對照組比較 *P＜0.05

0.21±0.07*0.20±0.06*0.28±0.05 11.395 0.009組別輕癥組重癥組對照組F值P值n 61 21 30 IgA IgG IgM 0.54±0.32 0.51±0.29 0.56±0.33 2.187 0.417 11.42±3.09*11.05±2.88*8.31±1.95 9.146 0.022 1.51±0.28*1.43±0.25*0.91±0.21 6.275 0.046 C3 C4 0.94±0.11*0.89±0.13*1.09±0.14 7.309 0.039

表3 三組細胞因子比較（±s）

表3 三組細胞因子比較（±s）

注：與對照組比較 *P＜0.05，與重癥組比較 #P＜0.05。

8 3.5 7±2 6.5 9*#4 3 1.8 3±9 8.7 4*3 9.9 6±1 8.4 0 7 3.0 8＜0.0 0 1組別輕癥組重癥組對照組F值P值n 6 1 2 1 3 0 I L－6 I L－1 0 T N F－α 2 5.8 6±4.8 2*#6 2.4 0±9.3 5*1 5.8 9±3.1 7 2 7.8 5 4＜0.0 0 1 4 6.7 5±1 6.9 5*#1 7 1.5 0±5 2.4 1*2 3.8 0±1 1.4 4 4 9.3 6 1＜0.0 0 1

3 討論

手足口?。℉FMD）是由多種腸道病毒誘發(fā)的常見兒童傳染病，5歲以下嬰幼兒為易感人群[4，5]。誘發(fā)手足口疾病的腸道病毒主要為腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型，其中EV71病毒的傳染性較強，隱性感染比例較大，傳播途徑較為復雜，傳播速度較快，成為手足口的重要致病菌[6，7]。EV71病毒具有顯著的嗜皮膚與嗜神經特性，對患者造成的臨床病癥程度不一致，病情輕者會出現(xiàn)自限性手足口病或皰疹性咽峽炎，病情較重者則會損害中樞神經、呼吸系統(tǒng)，誘發(fā)腦水腫、心肌炎、腦炎等臨床病癥，對患者的生命安全造成嚴重影響。EV71病毒導致手足口病的發(fā)病機制尚未明確，可能與患者免疫系統(tǒng)相關[8，9]。

先天性免疫是人類機體抗病毒感染的第一道防線，自然殺傷細胞（NK）作為關鍵細胞，在EV71手足口疾病中發(fā)揮重要作用。EV71感染后患者機體內NK細胞不斷減少，會下調激活型受體NKG2D表達，上調抑制型受體CD94與NKG2A的表達以抑制NK細胞的活化，不能使其胞漿內PE、GrB與GNLY等細胞毒顆粒分泌至胞外，不能對已感染EV71的細胞發(fā)揮有效殺傷作用[10，11]。CD3+、CD4+、CD8+是一類具有免疫調節(jié)作用的T細胞亞群，能夠通過細胞接觸機制或細胞因子抑制機制調控免疫反應，發(fā)揮了T細胞的免疫調節(jié)作用，其中CD4+協(xié)調B淋巴細胞分化產生抗體，CD8+具有抑制抗體合成、分泌作用，兩者的協(xié)調維持了人類機體的正常免疫應答[12，13]。本研究中，重癥組、輕癥組的CD3+、CD4+、NK細胞比例均顯著的低于對照組，CD8+細胞比例顯著的高于對照組 （P＜0.05）；重癥組的CD3+、CD4+、NK細胞比例均顯著的低于輕癥組，CD8+細胞比例顯著的高于輕癥組 （P＜0.05），這說明EV71感染所致手足口患者免疫系統(tǒng)紊亂，其免疫水平隨著病情的加重而不斷變化。

IgG是唯一通過胎盤的一種免疫球蛋白，在小兒出生6個月后因代謝分解而逐漸消失，直至學齡期機體內的IgG成分接近于成人，IgG能夠針對蛋白質多肽抗原產生免疫應答，具有中和游離外毒素、病毒，能夠發(fā)揮吞噬細胞的作用，是下呼吸道的重要保護性抗體[14]。IgM是機體初次體液免疫反應的重要免疫球蛋白，其半衰期為5d，在血液中的存在時間較短，機體免疫應答反應會導致其水平升高[15]。C3、C4作為補體系統(tǒng)中的重要分子，是衡量機體炎性的重要指標，其水平變化與患者的炎癥反應、機體免疫力具有密切聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，重癥組、輕癥組患兒與對照組的IgA水平無差異性，重癥組、輕癥組的IgG、IgM顯著的高于對照組，C3、C4均顯著的低于對照組；重癥組、輕癥組的 IgA、IgG、IgM、C3、C4 相比無差異性， 這表明EV71感染所致的手足口病抗病毒抗體均屬于IgG、IgM，其水平降低會降低患者呼吸道黏膜的防御能力，無法阻止病毒入侵體液而加重病情。本研究還發(fā)現(xiàn)，重癥組、輕癥組的 IL－6、IL－10、TNF－α顯著的高于對照組；重癥組 IL－6、IL－10、TNF－α 顯著的高于輕癥組（P＜0.05），這提示 EV71 感染手足口病患者血清中 IL－6、IL－10、TNF－α 等炎癥因子隨著病情的加重，其水平不斷上升，由于IL－6、IL－10、TNF－α對中性粒細胞、巨噬細胞、免疫功能細胞具有激活作用，過度表達會刺激患者局部炎癥反應，加重病情。因此，臨床根據(jù)免疫學指標的變化，針對性治療手足口患兒，輕癥者采用西瓜霜噴劑，清熱解毒、消腫止痛，利于消除口腔潰瘍。重癥者口服利巴韋林顆粒，該藥物屬于合成的核苷類抗病毒藥，是廣譜抗病毒藥物，進入被病毒感染的細胞后會迅速磷酸化，損害病毒RNA合成，選擇性的抑制病毒復制，緩解臨床病癥。

綜上所述，EV71病毒感染HFMD患兒多存在顯著的免疫功能紊亂，表現(xiàn)為患兒的細胞免疫水平降低、體液免疫反應增強。臨床治療時應在緩解患者臨床病癥的同時改善其免疫水平，增強患者機體免疫力。但由于本研究的樣本量、隨訪時間有限，尚未對藥物治療的療效進行分析，有待于進一步深入探究。

[1]謝海珍，祝曉靜，陸紅云，等.1728例手足口病病原學檢測結果分析及臨床意義[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2015，33(1)：74－76.

[2]孫春艷，徐書珍，張定榮，等.手足口病患兒早期抗炎－促炎機制及免疫功能變化的研究 [J].中華婦幼臨床醫(yī)學雜志：電子版，2014，7(5)：86－89.

[3]祝益民.手足口病防治指南[M].長沙：湖南科學技術出版社，2008：36－37.

[4]Junping P，F(xiàn)an Y，Zhaohui X，et al.Sensitive and rapid detection of viruses associated with hand foot and mouth disease using multiplexed MALDI－TOF analysis[J].J Clin Virol，2013，56(2)：170－174.

[5]Zhuang D，Hu W，Ren H，et al.The influences of temperature on spatiotemporal trends of hand－foot－and－mouth disease in mainland China[J].UEHR，2014，24(1)：1－10.

[6]Ben－Chetrit E，Wiener－Well Y，Shulman LM，et al.Coxsackievirus A6－related hand foot and mouth disease：skin manifestations in a cluster of adult patients[J].J Clin Virol，2014，59(3)：201－203.

[7]高勇，徐元宏，陳曉楓，等.EV71型手足口病患兒外周血樹突狀細胞及細胞因子產生的調節(jié)機制研究 [J].安徽醫(yī)科大學學報，2017，52(1)：78－82.

[8]王曉宇，成怡冰，宋春蘭.丙種球蛋白對EV71相關重癥手足口病患兒熱休克蛋白70水平的影響 [J].廣東醫(yī)學，2016，37(17)：2663－2666.

[9]謝瑞玉，李維春，朱磊，等.不同型腸道病毒感染手足口病兒童的病毒臨床特點比較 [J].中華醫(yī)院感染學雜志，2017，27(11)：2614－2617.

[10]薛霖，余楠，郭勇暉，等.手足口病相關腸道病毒感染血清中交叉抗體反應的初步鑒定 [J].中華疾病控制雜志，2015，19(7)：655－658.

[11]陳潔，周愛華，陳曉晴，等.手足口病患兒甘露醇結合凝集素基因多態(tài)性與其蛋白水平的研究 [J].中華醫(yī)院感染學雜志，2015，8(11)：2405－2407.

[12]宋新文，申保生，王宏偉.手足口病并腦炎患兒腦脊液和血清腫瘤壞死因子－α、S1OOB的變化及其臨床意義 [J].中華實用兒科臨床雜志，2013，28(10)：794－795.

[13]陳清.IL－6和IL－13與EV71型腸道病毒感染手足口病患者發(fā)病的相關性[J].重慶醫(yī)學，2015，45(26)：3634－3636.

[14]謝金純，林廣裕，陸學東，等.手足口病患兒血清細胞因子水平及其與病情的相關性[J].中華實用兒科臨床雜志，2013，28(10)：756－759.

[15]張克昌，曹明杰，李維春，等.手足口病患兒體內淋巴細胞亞群和細胞因子水平變化及意義[J].山東醫(yī)藥，2013，53(7)：19－22.