摘要:目的:根據(jù)中國藥典2015年版門冬氨酸鳥氨酸有關(guān)物質(zhì)項下的方法,利用HPLC法檢測門冬氨酸鳥氨酸,各物質(zhì)的分離度不符合中國藥典2015年版要求。本文主要研究色譜條件的改變對門冬氨酸鳥氨酸各雜質(zhì)分離度的影響,以得到較好的色譜條件進(jìn)行門冬氨酸鳥氨酸的研究。方法:采用HPLC法檢測門冬氨酸鳥氨酸各物質(zhì)分離度。結(jié)論:0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH5.60±0.05):乙腈=40:60;檢測波長:205nm;流速:1.0ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μl時,各物質(zhì)的分離效果最佳。
關(guān)鍵詞:中國藥典;HPLC法;門冬氨酸鳥氨酸;分離度
門冬氨酸鳥氨酸是由門冬氨酸和鳥氨酸合成,可用于治療因急、慢性肝病引發(fā)的血氨升高及肝性腦病[1,2]。目前有以下幾種檢測門冬氨酸鳥氨酸有關(guān)物質(zhì)的方法:柱前衍生HPLC法、柱后衍生化法和HPLC法[3,4]。柱前衍生HPLC法和柱后衍生化法均不太適用于有關(guān)物質(zhì)的檢查,重復(fù)性差,準(zhǔn)確性低。HPLC法屬性強(qiáng),準(zhǔn)確性好。耐用性高,操作方便
1、儀器與試藥
1.1 儀器
高效液相色譜儀Agilent1260(德國安捷倫科技有限公司);高效液相色譜儀1260(安捷倫科技有限公司);ML204T型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);XSE205DU型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);UltimateXB-NH2型色譜柱(Welch)
1.2試藥
門冬氨酸鳥氨酸對照品(中國食品藥品檢定研究院;批號:140749-201502;含量:96.6%);
馬來酸對照品(中國食品藥品檢定研究院;批號:190015-201302;含量:99.7%);富馬酸對照品(中國食品藥品檢定研究院;批號:111541-201102;含量:99.4%);精氨酸對照品(中國食品藥品檢定研究院;批號:140685-201506;含量:99.9%);3-氨基-2-哌啶酮(雜質(zhì)Ⅰ)對照品(QUALITY CONTROL CHEMICALS INC.;批號:21-OCT-14-2;含量:100%);
門冬氨酸縮合物(雜質(zhì)Ⅱ)對照品(QUALITY CONTROL CHEMICALS INC.;批號:12-MAY-17-0;含量:98.23%)。
乙腈為色譜級,磷酸二氫鉀、濃氨溶液、磷酸試劑均為分析純。
2、方法與結(jié)果
2.1《中國藥典》2015年版門冬氨酸鳥氨酸色譜條件
色譜柱:氨基鍵合硅膠為填充劑;流動相:0.02mol/L磷酸二氫鉀(取磷酸二氫鉀2.72g,加水500ml溶解后,加入濃氨溶液5ml,用水稀釋至1000ml,混勻后用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.60±0.05):乙腈=40:60;檢測波長:205nm;流速:1.3ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μl。
2.2溶液的制備
2.2.1供試品溶液的制備
取門冬氨酸鳥氨酸原料藥0.4g,精密稱定,置100ml量瓶中,加0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液40ml使溶解,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。
2.2.2對照溶液的制備
精密量取門冬氨酸鳥氨酸供試品溶液適量,加流動相定量稀釋制成每1ml含門冬氨酸鳥氨酸4μg的溶液,作為對照溶液。
2.2.3雜質(zhì)對照品溶液的制備
精密稱取馬來酸、富馬酸、精氨酸、3-氨基-2-哌啶酮(雜質(zhì)Ⅰ)與門冬氨酸縮合物(雜質(zhì)Ⅱ)各對照品適量,分別加流動相溶解并定量稀釋成每1ml中約含4μg的溶液,作為各雜質(zhì)對照品溶液。
2.2.3系統(tǒng)適用性溶液的制備
另取門冬氨酸鳥氨酸、馬來酸、富馬酸、精氨酸、雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ各對照品適量,置同一量瓶中,加流動相適量使溶解并稀釋制成每1ml中約含門冬氨酸鳥氨酸4mg,馬來酸、富馬酸、精氨酸、雜質(zhì)Ⅰ與雜質(zhì)Ⅱ各4μg的溶液,作為系統(tǒng)適用性溶液。
2.3色譜條件的篩選
2.3.1流動相比例的篩選
以0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH5.60±0.05):乙腈=40:60(圖1)、50:50(圖2)、30:70(圖3)、35:65(圖4)為流動相,分兩個泵;檢測波長:205nm;
流速:1.3ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μl。(不包含雜質(zhì)Ⅰ雜質(zhì)Ⅱ)各流動相色譜圖如下:
由上述四圖可得,以0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH5.60±0.05):乙腈=30:70為流動相,分兩個泵時,各物質(zhì)分離度均符合要求。
以0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH5.60±0.05):乙腈=30:70為流動相,混合;檢測波長:205nm;流速:1.3ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μl。色譜圖如下:
以0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH5.60±0.05):乙腈=30:70為流動相,混合時,系統(tǒng)不符合試驗要求。
2.3.2流動相pH的篩選
以0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH5.60±0.05(圖六)、pH4.2±0.1(圖七)、pH4.9±0.1(圖八)):乙腈=40:60為流動相;檢測波長:205nm;流速:1.3ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μl。(不包含雜質(zhì)Ⅰ雜質(zhì)Ⅱ)各流動相色譜圖如下:
由上述圖譜可得,0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH5.60±0.05,各物質(zhì)的分離度均符合要求。
2.3.3流速的篩選
以0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH5.60±0.05):乙腈=40:60為流動相;檢測波長:205nm;流速:1.3ml/min、1.0ml/min、0.7ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μl(包含雜質(zhì)Ⅰ雜質(zhì)Ⅱ)。
當(dāng)流速為1.0ml/min時,系統(tǒng)適用性溶液中各雜質(zhì)分離度均符合中國藥典2015版要求。
3、討論
由以上試驗得出,當(dāng)色譜條件為:0.02mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH5.60±0.05):乙腈=40:60;檢測波長:205nm;流速:1.0ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μl時,各物質(zhì)的分離效果最佳。以此為色譜條件進(jìn)行門冬氨酸鳥氨酸研究。
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