降解亞硝酸鹽的乳酸菌的分離篩選

摘要：從實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株中分離純化出乳酸菌 105株，再進(jìn)行降解亞硝酸鹽初篩試驗(yàn)，用比色法觀察獲得6株降解亞硝酸鹽能力較強(qiáng)的菌株，再通過(guò)計(jì)算降解率選出1株降解亞硝酸鹽作用明顯的菌株，該菌株按1% （v/v）接種量接種于125 mg /L NaNO2、pH 6.4 MRS培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，對(duì) NaNO2的降解率達(dá)95.81% 。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；亞硝酸鹽；降解；

近年來(lái)，諸多文獻(xiàn)中報(bào)道乳酸菌可降解亞硝酸鹽，許多研究者在接種乳酸菌腌漬發(fā)酵蔬菜試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，接種發(fā)酵能顯著降低亞硝酸鹽生成[1，2]。楊潔彬[3]等認(rèn)為植物乳桿菌經(jīng)亞硝酸鹽的誘導(dǎo)，能產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶。張慶芳[4]等對(duì)乳酸菌降解亞硝酸鹽機(jī)理進(jìn)行了研究，認(rèn)為其降解機(jī)理為：乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解分為酶降解和酸降解2個(gè)階段。在發(fā)酵前期，培養(yǎng)液pH值>4.5時(shí)，乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽降解以酶降解為主；發(fā)酵后期，亞硝酸鹽的降解主要以酸降解為主。但在其研究過(guò)程中，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，乳酸菌會(huì)產(chǎn)生大量乳酸，而乳酸對(duì)亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的降解作用。

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1改良MRS培養(yǎng)基的配制

以配制1 L液體培養(yǎng)基為例，需要蛋白胨5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，吐溫80 1.0 g，葡萄糖20.0 g，檸檬酸氫二胺2.0 g，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，磷酸氫二銨2.0 g，蒸餾水950 mL。

1.2平板涂布法

取實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株解凍后，用漩渦混合儀混合均勻，然后用酒精消毒涂布器取各菌液100 μL滴在平板上，在酒精燈環(huán)境下，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，移動(dòng)涂布器，直到?jīng)]有明顯液體為止，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在30 ℃下培養(yǎng)48 h后用平板劃線法進(jìn)行純化。

1.3平板劃線法

用已消毒的牙簽，挑出不同種類的菌種在新的MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線。在30 ℃下培養(yǎng)48 h后進(jìn)行第二次劃線培養(yǎng)。與第一次劃線培養(yǎng)平板中的菌種比較，并挑出不同的菌種，再一次進(jìn)行平板劃線以純化。在30 ℃下培養(yǎng)48 h。

1.4過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)

在載玻片上滴一滴濃度為3%的過(guò)氧化氫溶液，從第二次劃線的平板上挑去少量菌，均勻涂抹在溶液上，觀察是否有氣泡產(chǎn)生。有氣泡說(shuō)明此菌為過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，無(wú)氣泡說(shuō)明此菌為過(guò)氧化氫酶陰性。

1.5革蘭氏染色

被染成紫色說(shuō)明此菌為革蘭氏陽(yáng)性，被染成紅色說(shuō)明此菌為革蘭氏陰性。乳酸菌為過(guò)氧化氫酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性菌。

1.6 MRS液體培養(yǎng)

用接種環(huán)挑取平板上符合條件的菌種，接種到液體培養(yǎng)基中，震蕩。在30 ℃下培養(yǎng)24 h。將第一次液體培養(yǎng)的試管震蕩均勻，從中取1%接種量加入到MRS液體培養(yǎng)基中，震蕩。

1.7降解亞硝酸鹽乳酸菌的分離篩選

1.7.1降解亞硝酸鹽乳酸菌的初篩

將供試菌株活化，取菌齡為18 h的培養(yǎng)液，按1%（v/v）接種量接種于10 mL含NaNO2 125 mg/L，pH 6.4的MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)72 h。將培養(yǎng)液混勻，加入2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，避光靜置5 min，再加入l mL鹽酸萘乙二胺溶液，混勻，避光靜置15 min，觀察各培養(yǎng)液的顏色變化，選出顏色較淺的菌株，進(jìn)行復(fù)篩。

1.7.2亞硝酸鹽含量的測(cè)定

采用GB 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中的鹽酸萘乙二胺法對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行測(cè)定。

1.7.3降解亞硝酸鹽乳酸菌的復(fù)篩

將初篩所得菌株活化，按初篩相同操作進(jìn)行接種培養(yǎng)，每12 h 取樣檢測(cè)亞硝酸鈉含量，以含NaNO2未接種培養(yǎng)基為對(duì)照，計(jì)算亞硝酸鹽降解率，選取亞硝酸鹽降解力強(qiáng)的菌株。

1.8菌種的保藏

取500 μL經(jīng)121 ℃滅菌15 min的50%甘油于EP管中，再取等量菌懸液，混勻后標(biāo)好編號(hào)，置于-80 ℃冰箱中保藏。

2 結(jié)果與分析

2.1分離純化的乳酸菌株

經(jīng)過(guò)MRS平板培養(yǎng)初步分離純化出溶鈣明顯菌株105株，經(jīng)過(guò)革蘭氏染色鏡檢，過(guò)氧化氫酶反應(yīng)，保存革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性菌株105株。通過(guò)比色法篩選出6株降解亞硝酸鹽能力較強(qiáng)的乳酸菌，并進(jìn)行菌落形態(tài)學(xué)觀察以及過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)和革蘭氏染色。

2.1.1菌落形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

初篩的6株菌株菌落都呈圓形，菌落表面光滑，且多數(shù)菌落邊緣整齊，菌落均有較明顯的突起。另外，所得菌落均具有明顯的鈣圈。

2.1.2菌株特性

對(duì)初篩的菌株進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)和革蘭氏染色，篩掉過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌，所得菌株均為過(guò)氧化氫酶陰性和革蘭氏染色陽(yáng)性，為乳酸菌株的進(jìn)一步判斷提供依據(jù)。

通過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)和革蘭氏染色篩選后，所得試驗(yàn)菌株均為革蘭氏陽(yáng)性菌，過(guò)氧化氫酶陰性菌。顯微鏡下觀察可見(jiàn)所有菌株都無(wú)芽孢存在，且菌體多成桿狀。

2.2亞硝酸鹽降解菌的初篩結(jié)果

將105株乳酸菌株按1%（v/v）接種量接入含125 mg/L的亞硝酸鹽的MRS培養(yǎng)液中，培養(yǎng)72 h，其鹽酸萘乙二胺顯色結(jié)果分為4類：淺黃色48株，水粉紅色6株，紅色17株，紫紅色34株。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中相同的亞硝酸鹽經(jīng)不同乳酸菌的降解作用后，殘留的亞硝酸鈉越少，其紅色越淺。因此，選取其中顯水粉色的6株菌進(jìn)行降解亞硝酸鹽復(fù)篩測(cè)定。

2.3亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測(cè)得亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4.3所示。所得回歸方程為： y=0.1506x+0.0039。乳酸菌培養(yǎng)過(guò)程中的亞硝酸鹽含量每隔12 h測(cè)定一次，共測(cè)定72 h。通過(guò)此回歸方程可計(jì)算出亞硝酸鹽含量的動(dòng)態(tài)變化。

2.4菌株亞硝酸鹽降解率的測(cè)定

對(duì)6株供試菌株，按1% （v/v）接種量接入含125 mg /L的亞硝酸鹽培養(yǎng)液中，30 ℃培養(yǎng)，每12 h取培養(yǎng)液，測(cè)亞硝酸鹽含量，計(jì)算菌株在MRS培養(yǎng)基中對(duì)亞硝酸鈉的降解率。

除了對(duì)照組中亞硝酸鹽含量沒(méi)有太大的變化外，且降解率在10%左右，其余各菌對(duì)亞硝酸鹽均有一定降解作用。

3 總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株中分離篩選優(yōu)良乳酸菌105株菌進(jìn)行測(cè)試，樣本量大，保證了所得菌株優(yōu)良性狀的穩(wěn)定。通過(guò)比色法篩選得到6株具有降解亞硝酸鹽能力的乳酸菌。其中有5株乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽具有高降解率（>90%），1株乳酸菌具一定的降解率（72.96%），這6株乳酸菌在12～24 h內(nèi)降解量最大，36 h后降解量變化相對(duì)較小。

參考文獻(xiàn)：

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[2]孟憲軍. 大白菜乳酸發(fā)酵菌種選育及發(fā)酵特性的研究[D]. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)， 1999.

[3]楊潔彬. 乳酸菌的生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用[M]. 北京： 中國(guó)輕工業(yè)出版社， 1996.

[4]張慶芳，遲乃玉，鄭燕等. 乳酸菌降解亞硝酸鹽機(jī)理的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2002， 28（08）： 55-60.

作者簡(jiǎn)介：

孫家財(cái)（1981-）男，漢族，山東牟平人，職稱：助教，學(xué)歷：碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。

孫海峰（1981-）女，漢族，山東廣饒人，職稱：講師，學(xué)歷：碩士研究生，研究方向：果蔬加工。