魚類水霉病植物源性殺菌劑的篩選

摘 要：為探究魚類水霉病植物源性殺菌劑的抑菌效果，以水霉病菌為供試病菌，選取了多種具有消炎、殺菌功效的藥用植物進(jìn)行抑菌活性篩選，以抑菌圈直徑大小為指標(biāo)，確定植物提取物對(duì)水霉菌的抑菌效果；篩選抑菌效果較強(qiáng)的植物提取物，測(cè)定其對(duì)水霉菌的最低抑菌濃度（MIC）、最低殺菌濃度（MBC），以及其對(duì)水霉菌生長(zhǎng)抑制率、菌絲生長(zhǎng)量的影響。結(jié)果表明：黃連、油茶餅、大黃等植物提取液對(duì)水霉菌的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)抑制效果；三者對(duì)水霉菌的MIC值均較低，分別為3.125、6.25、12.5 mg/mL，對(duì)水霉菌的MBC值相差不大，均在為50 mg/mL左右?？傮w上，黃連表現(xiàn)出了相對(duì)最優(yōu)的抑菌效果，當(dāng)黃連提取液處理濃度達(dá)到500 mg/L時(shí)，抑菌率達(dá)到97%以上，菌絲鮮重低于0.02 g，抑菌效果最佳。

關(guān)鍵詞：水霉?。霍~類；植物源性提取物；抑菌

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2018）09-0084-05

Screening of Botanical Fungicides for Fish Water Mildew

QI Jian-bo1，HE Xiao-e2，HU Qian2，GUO Yang1，SHI Hao1，2

（1. College of Horticulture and Landscape， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC； 2. College of Agriculture

and Forestry， Hunan Applied Technology University， Changde 415000， PRC）

Abstract： To explore t the antibacterial effect of plant extracts against Botryosphaeria dothidea， and to provide direction for the development and use of safe and effective drugs for the treatment. In this paper， Botryosphaeria dothidea was used as test pathogens. A variety of plants with anti-inflammatory and bactericidal were selected for antibacterial activity screening. The growth rate and growth of mycelia were used as indicators to determine the antibacterial effect of plant extracts on Botryosphaeria dothidea. Then， the plant extracts with effective antibacterial effect were selected to determine the minimum inhibitory concentration （MIC）， the minimum bactericidal concentration （MBC）， and the growth inhibition rate and mycelial growth of Botryosphaeria dothidea. The experimental results showed that the extracts of Coptis chinensis， Camellia and Rheum palmatum have effective inhibitory effects on the growth of Botryosphaeria dothidea. The MIC values of the three extracts were 3.125 mg/mL， 6.25 mg/mL and 12.5 mg/mL， there was no significant difference in the MBC values， and they were all around 50 mg/mL. In general， Coptis chinensis showed the best antibacterial effect， when the concentration of Coptis chinensis extract reached 500 mg/L， the antibacterial rate reached more than 97%， and the fresh weight of hyphae was less than 0.02 g.

Key words： saprolegniasis； fish； plant extract； antibacterial

水霉?。⊿aprolegniasis），又叫膚霉?。―erma-tomyeosis）或白毛病，是淡水水生動(dòng)物較常見的疾病之一，該病是由于水霉菌寄生在魚體表面引起的一種高致病性真菌性疾病[1]。如果菌絲附著在魚鱗上，經(jīng)常導(dǎo)致鱗片脫落[2]。當(dāng)受傷較深時(shí)，水霉菌可向內(nèi)深入肌肉，蔓延到組織細(xì)胞間隙，向外長(zhǎng)成的菌絲，呈灰白色的棉毛狀，故稱“白毛病”，在高密度的成魚飼養(yǎng)過(guò)程中常發(fā)生此病[3]。過(guò)去使用安全性較低的孔雀石綠作為該疾病的首選藥物，但孔雀石綠具有高毒性、致癌、致畸和致突變的副作用，我國(guó)于2000年將其列為禁用藥物[4]。因此，迫切需要尋找一種更加安全有效的藥物來(lái)控制該疾病。

相比較于化學(xué)合成藥物，中草藥是一種理想的天然綠色藥物，具有來(lái)源廣、成本低、藥效長(zhǎng)、使用方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[5]。其機(jī)理是阻斷或破壞真菌結(jié)構(gòu)及大分子的生物合成、干擾真菌的能量代謝、通過(guò)改善和提高生物體免疫功能和對(duì)其他抗真菌藥物的增效作用來(lái)殺滅或抑制真菌[6]。此外，還具有副作用少、毒性低、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)[7]，加之其本身含有一定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如粗蛋白、粗脂肪、維生素等，可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，近年來(lái)被廣泛用于防治各類水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害[8]。研究表明，五倍子或菖蒲能有效地防治魚類水霉病的發(fā)生[9]。李川等[10]用中草藥對(duì)患水霉病大鯢（Andrias davidianus）進(jìn)行治療，結(jié)果顯示大黃和五倍子2種藥液均對(duì)水霉菌有較好的抑制作用。筆者通過(guò)選擇多種植物源性殺菌劑，以水霉病菌為供試病菌，采用牛津杯法對(duì)植物提取物的抑菌效果進(jìn)行了研究，以期為魚類水霉病的綠色防治探索出新途徑，為解決魚類水霉病無(wú)公害藥物的研制與開發(fā)提供方向，達(dá)到提高水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益、減少養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失的目的，同時(shí)提高水產(chǎn)品的食品安全，提升人民健康水平。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料與試劑 供試植物共有64種，購(gòu)于湖南九芝堂醫(yī)藥有限公司和湖南養(yǎng)天和大藥房，部分常見植物自行采摘。藥材經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物資源工程專業(yè)肖深根教授鑒定。藥材名稱及藥用部位列于表1。供試菌種為水霉菌（Botryosphaeria dothidea），由湖南文理學(xué)院生命科學(xué)院羅玉雙教授提供。葡萄糖、瓊脂粉、丙酮（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）試劑為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 HVA-85全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋（上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司）；DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（無(wú)錫建儀實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；DH5000B電熱恒溫培養(yǎng)箱（西安禾普生物科技有限公司）；FA2004電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；pH計(jì)（METTLER TOLEDO公司）；TGCXZ-5B超聲循環(huán)提取機(jī)（北京弘祥隆公司）；FW100萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；Buchi R3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；LX-600P冷卻水循環(huán)機(jī)（北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司）；DSZ2000X倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司）；SR-A10N-50冷凍干燥機(jī)（上海舍巖儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物源性提取液的制備 （1）植物藥材打粉處理。采摘原植物經(jīng)自然風(fēng)干后放入50℃烘箱，烘干至恒重，用粉碎機(jī)粉后碎過(guò)100目篩。（2）提取液制備。分別稱取各植物樣品粉末10 g于100 mL三角瓶中，加丙酮50 mL用保鮮膜封口，18℃ 150 r/min恒溫振蕩提取12 h后，將三角瓶放入超聲儀中，再經(jīng)超聲波提取30 min，然后將提取液抽濾，濾液濃縮至10 mL以內(nèi)，倒入10 mL容量瓶中定容。配成活性物質(zhì)提取物，質(zhì)量濃度1.0 g/mL，對(duì)提取物母液進(jìn)行編號(hào)，置于4℃冰箱中，保存?zhèn)溆?。另將黃連、油茶、大黃提取物減壓濃縮后冷凍干燥。

1.2.2 菌液的制備 菌種活化后接種于PDA培養(yǎng)基，18℃培養(yǎng)72 h，取直徑約為4 cm的菌落于5 mL離心管中，用加2%吐溫80的無(wú)菌0.9%生理鹽水沖洗，再用玻璃珠打散，震蕩、離心、過(guò)濾菌絲。采用血球板計(jì)數(shù)法確定菌懸液濃度[11]，濃度控制在105～106 CFU/mL之間，備用。

1.2.3 PDA培養(yǎng)基的配制 將馬鈴薯洗凈去皮，稱取200 g，切成2 cm大小于1 L的燒杯中，加入蒸餾水300 mL左右，在電爐上煮沸30 min。抽濾得濾液，濾液到入燒杯中，相繼添加瓊脂15 g、葡萄糖16 g，加蒸餾水補(bǔ)至1 L，攪拌，放入微波爐中待其充分融化，自然pH值，分裝于250 mL錐形瓶中，加膜、包扎，121℃滅菌20 min，取出冷卻至40℃左右，鋪板或4℃冰箱保存。

1.2.4 提取液抑菌活性的測(cè)定 （1）抑制效果的測(cè)定。采用牛津杯法測(cè)定提取液對(duì)水霉菌的抑制率[12]。將PDA培養(yǎng)基倒入10 mL培養(yǎng)皿中至0.5 cm深度，凝固后，加入濃度為105～106個(gè)孢子/mL的菌懸液0.5 mL，用滅菌的小毛刷充分涂勻。取滅菌的牛津杯插入培養(yǎng)基中0.2 cm深度，每個(gè)培養(yǎng)皿等距離放置4個(gè)，再往各牛津杯中加入200 μL各植物提取液（采用0.22 μm的有機(jī)膜濾掉雜菌），用封口膜封口，置于18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)植物樣本做4個(gè)重復(fù)，以丙酮試劑為陰性對(duì)照，以80 μg/mL納他霉素為陽(yáng)性對(duì)照。培養(yǎng)72 h后用游標(biāo)卡尺、十字交叉法測(cè)定抑菌圈直

徑[13]。其中：菌落凈生長(zhǎng)距離（cm）=菌落生長(zhǎng)距離-菌餅直徑。（2）最低抑菌濃度（MIC）值的測(cè)定。取12孔板編號(hào)倒入底層培養(yǎng)基待凝固后，將植物提取液混入40℃培養(yǎng)基中，最終濃度為1、10、20、30、50、100、200、300、400、500、700、1 000 mg/mL，倒入培養(yǎng)基上，待凝固后鋪上濃度為105～106個(gè)孢子/mL的菌懸液0.3 mL，用滅菌的小毛刷充分涂勻。置于18℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌體生長(zhǎng)情況，記錄數(shù)據(jù)。（3）最低殺菌濃度（MBC）值的測(cè)定。將大于最低抑菌濃度的各提取液對(duì)倍提高濃度，混入40℃培養(yǎng)基中，并分別倒在底層培養(yǎng)基上，待凝固后鋪上菌懸液，用滅菌的小毛刷充分涂勻。置于18℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌體生長(zhǎng)情況，記錄數(shù)據(jù)。確定無(wú)菌生長(zhǎng)的最底提取液濃度。

1.2.5 提取物對(duì)菌生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定 提取物分別按質(zhì)量濃度0（CK）、10、50、100、300、500 mg/L制成PDA平板，在超凈工作臺(tái)上，將直徑0.9 cm的供試病菌菌餅塊置于含藥劑的培養(yǎng)基平板中央，每皿1塊，每處理3次重復(fù)，置于18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。按公式（1）計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率[14]。

菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)距離-處理菌落凈生長(zhǎng)距離）/對(duì)照菌落凈生長(zhǎng)距離×100 （1）

1.2.6 菌絲生長(zhǎng)量的測(cè)定 對(duì)水霉菌絲生長(zhǎng)量抑制作用的測(cè)定在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行。于三角瓶中加入培養(yǎng)基后高壓滅菌；將活化好的水霉菌用無(wú)菌生理鹽水清洗，過(guò)濾掉菌絲，制得孢子懸浮液（106 CFU）。培養(yǎng)基冷卻后在無(wú)菌條件下用移液槍加入孢子懸浮液1 mL，18℃振蕩培養(yǎng)，待菌絲球生長(zhǎng)良好時(shí)加入提取物，對(duì)照不加。繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，待菌絲球長(zhǎng)到直徑為0.5～1.0 cm。過(guò)濾得菌絲體，用蒸餾水反復(fù)沖洗菌絲，將培養(yǎng)基去除干凈，精確稱取菌絲體的鮮量。每個(gè)處理重復(fù)5次，試驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物提取液的抑菌活性

2.1.1 各植物提取液對(duì)菌體的抑制效果 由表2可知，24種植物提取液對(duì)水霉菌顯示出不同程度的抑菌效果，其中以黃連、油茶餅、大黃、苦參、五倍子、丁香、鳳尾蕨等的提取液抑制作用較為明顯，抑菌圈直徑均在20 mm以上。黃連提取物的抑菌效果最明顯，抑制直徑達(dá)36.1 mm，其原植物體內(nèi)可能有某種生物堿對(duì)水霉菌抑制效果較好[15]。同理推測(cè)大黃中可能含有某種蒽醌[16]、油茶中含某種皂甙對(duì)水霉菌也有較好的抑制效果[17]，今后可提取分離各組分作進(jìn)一步分析。還有可能是丙酮的極性與這3種藥材的有效成分極性相似，更易溶，故提取效果更好一些[18]。

2.1.2 各植物提取液對(duì)菌體的MIC和MBC 由表3可知，黃連、油茶餅、大黃對(duì)水霉菌的MIC值較低，分別為3.125、6.25、12.5 mg/mL，對(duì)水霉菌的MBC值均為50 mg/mL?？梢姡S連、油茶餅和大黃的對(duì)水霉菌抑制效果突出。其中，黃連的MIC最低，說(shuō)明其對(duì)水霉菌抑制效果最好，與十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑試驗(yàn)結(jié)果相同。且該試驗(yàn)抑菌效果和十字法測(cè)定的抑菌圈直徑結(jié)果基本一致，2個(gè)試驗(yàn)互相印證了幾種植物提取液對(duì)水霉菌的抑制作用。

2.2 不同濃度植物提取物對(duì)水霉菌生長(zhǎng)的抑制率

2.2.1 油茶餅提取物 由圖1可知，油茶餅提取物對(duì)水霉菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用。隨著提取物濃度增強(qiáng)，對(duì)水霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率逐漸增強(qiáng)，但是有其一定的范圍；當(dāng)油茶餅提取物濃度由300 mg/L增至500 mg/L時(shí)，抑制率由95%增至97%，增長(zhǎng)效果不明顯。因此，油茶餅提取物濃度在300～500 mg/L時(shí)抑菌效果最佳。

2.2.2 黃連提取物 由圖2可知，黃連提取物對(duì)水霉菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用。隨著提取物濃度增強(qiáng)，對(duì)水霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率逐漸增強(qiáng)，但是有其一定的范圍；當(dāng)提取物濃度由300 mg/L增至500 mg/L時(shí)，抑菌率由97%增至99%，增長(zhǎng)效果不明顯。因此，考慮到應(yīng)用成本，黃連提取物濃度在300～500 mg/L時(shí)抑菌效果最佳。

2.2.3 大黃提取物 由圖3可知，大黃提取物對(duì)水霉菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用。隨著提取物濃度增強(qiáng)，對(duì)水霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率逐漸增強(qiáng)，但是有其一定的范圍；當(dāng)大黃提取物濃度由300 mg/L增至500 mg/L時(shí)，抑菌率由87%增至90%，增長(zhǎng)效果不明顯。因此，大黃提取物濃度在300～500 mg/L時(shí)抑菌效果最佳。但與油茶餅和黃連相比，對(duì)水霉菌的抑制效果稍弱。

2.3 不同濃度植物提取物對(duì)水霉菌生長(zhǎng)量的影響

2.3.1 油茶餅提取物 由圖4可知，當(dāng)油茶餅提取物濃度為0、100、500、1 000 mg/L時(shí)，菌絲鮮重分別為0.121、0.063、0.008、0.005 g，再提高植物源提取物濃度，抑菌效果增強(qiáng)不明顯。這說(shuō)明當(dāng)油茶餅提取物濃度在0～500 mg/L時(shí)，對(duì)水霉菌菌絲生長(zhǎng)量減少作用變化最明顯。

2.3.2 黃連提取物 由圖5可知，當(dāng)黃連提取物濃度為0、100、500、1 000 mg/L時(shí)，菌絲鮮重分別為0.121、0.072、0.014、0.006 g，再提高植物源提取物濃度，抑菌效果增強(qiáng)不明顯。這說(shuō)明當(dāng)黃連提取物濃度在0～500 mg/L時(shí)，對(duì)水霉菌菌絲生長(zhǎng)量減少作用變化最明顯。當(dāng)油茶餅和黃連提取物濃度處于同一水平時(shí)（1 000 mg/L），油茶餅提取物的抑制效果略強(qiáng)于黃連，與上述試驗(yàn)結(jié)果稍有差異，推測(cè)可能是達(dá)到了一定極限范圍時(shí)，油茶餅提取物的抑菌效果與黃連提取物抑菌效果相差不大。

2.3.3 大黃提取物 由圖6可知，當(dāng)大黃提取物濃度是0、100、500、1 000 mg/L時(shí)菌絲鮮重為0.121、0.092、0.042、0.032 g，說(shuō)明當(dāng)大黃提取物濃度在100～500 mg/L時(shí)，對(duì)水霉菌菌絲生長(zhǎng)量減少作用變化最明顯。在提取物濃度為500和1 000 mg/L時(shí)，大黃提取物抑菌效果相差不大，且弱于黃連和油茶餅的抑菌效果。

3 結(jié)論與討論

在廣泛查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選取了64種具有抑菌活性的中草藥植物，測(cè)定其對(duì)水霉菌的離體抑制效果。結(jié)果表明，有23種植物提取液對(duì)水霉菌表現(xiàn)出不同程度的抑制效果，其中以黃連、油茶餅、大黃、苦參、五倍子、丁香、鳳尾蕨等植物的提取液對(duì)水霉菌效果較好，抑菌圈直徑均達(dá)20 mm以上。尤其是黃連、油茶餅和大黃的抑菌效果突出，其提取物的MIC分別為3.125、6.25、12.5 mg/mL，對(duì)水霉菌的MBC均為50 mg/mL。同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著植物源提取物濃度增強(qiáng)，對(duì)水霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率逐漸增強(qiáng)，但是當(dāng)抑制范圍達(dá)到一定程度時(shí)，即使再提高植物源提取物濃度，抑菌效果增強(qiáng)不明顯，油茶餅、黃連、大黃提取物濃度都在300～500 mg/L時(shí)抑菌率增效不明顯；即提取物濃度在0～500 mg/L時(shí)，對(duì)水霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)。黃連提取液濃度達(dá)到500 mg/L時(shí)，抑菌效果最佳，幾乎可對(duì)水霉菌進(jìn)行完全抑制，在未來(lái)魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用于魚類水霉菌的綠色防控。

目前對(duì)植物源提取物的抑菌試驗(yàn)還處在室內(nèi)細(xì)菌培養(yǎng)階段，后期可研發(fā)魚類水霉病植物源性殺菌劑進(jìn)行室外防治研究，并且分析其具體成分和作用機(jī)理，為今后相關(guān)安全有效藥物的開發(fā)與使用提供一定理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 許佳露. 魚類水霉病疾病模型的構(gòu)建及應(yīng)用[D]. 上海：上海海洋大學(xué)，2012.

[2] 汪建國(guó). 淡水養(yǎng)殖魚類疾病及其防治技術(shù)（35）——羅非魚疾病（二）[J]. 漁業(yè)致富指南，2016，（11）：53-56.

[3] 卓金亮. 香魚水霉病及其它疾病的防治[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚，2003，（6）：41.

[4] 楊先樂(lè)，郭 珺. 孔雀石綠的禁用及其替代藥物美婷[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，31（2）：11-14.

[5] 王文彬. 中草藥防治魚病八項(xiàng)注意[J]. 中國(guó)水產(chǎn)，2006，（1）：60-61.

[6] 高文清，李東霞. 中草藥抗真菌作用的研究近況[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2009，15（6）：915-918.

[7] 陳昌福，胡衛(wèi)平，徐 輝，暴血停（大蒜素粉）防治魚類水霉病的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 漁業(yè)致富指南，2006，（16）：52-53.

[8] 王文彬. 常用中草藥防治魚病的技巧[J]. 漁業(yè)致富指南，2004，（22）：51-52.

[9] Kaijser B，Sorgaard M. Replacing malachitegreen[J]. Fish Farming International，2001，28（7）：25.

[10] 李 川，何登菊，牟洪民，等. 大鯢水霉病中草藥治療試驗(yàn)[J]. 河北漁業(yè)，2010，38（1）：33.

[11] 袁洪威，陳湖芳，高東民，等. 分光光度法測(cè)定黑曲霉孢子濃度的研究[J]. 中國(guó)釀造，2017，36（4）：122-126.

[12] 劉 洋，陳楚英，陳 明，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化肉桂抑菌物質(zhì)超聲波提取工藝及其抑菌活性研究[J]. 食品科技，2015，（6）：279-284.

[13] 孫 俊. 榛子葉斑病病原菌生物學(xué)特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（7）：101-103.

[14] 周 應(yīng)，唐燕霞，包海鷹. 滅幼脲對(duì)4種真菌菌絲生長(zhǎng)的影響[J]. 菌物研究，2017，15（2）：137-139.

[15] 楊 勇，葉小利，李學(xué)剛. 4種黃連生物堿的抑菌作用[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（12）：3013-3014.

[16] 劉志兵，王海鷗. 中藥大黃中蒽醌衍生物成分分析及其穩(wěn)定性[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2003，22（5）：53-56.

[17] 唐紅楓，孫 茜，張雨婷，等. 油茶皂甙的提取及抑菌活性研究[J]. 中國(guó)油脂，2012，37（2）：69-71.

[18] 王小燕，陳 映. 丙酮紅外光譜的溶劑效應(yīng)[J]. 溫州大學(xué)學(xué)報(bào)（社會(huì)科學(xué)版），2004，17（1）：26-30.

（責(zé)任編輯：夏亞男）