稻瘟病拮抗放線菌CZ133的篩選、鑒定及抑菌活性分析

摘 要：采用平板對峙法，從湖南水稻根際土壤樣品中篩選對水稻稻瘟病具有抑菌活性的拮抗放線菌，通過菌落和菌株形態(tài)、16S rDNA和gyrB基因序列對拮抗放線菌進行鑒定，并分析了其發(fā)酵濾液對稻瘟病病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果顯示：分離純化得到了1株對稻瘟病具有顯著抑菌活性的拮抗放線菌CZ133，其對稻瘟病病原菌的平均抑制率為59.47%，經(jīng)鑒定屬于鏈霉菌屬；該菌株發(fā)酵濾液能顯著抑制稻瘟病病原菌菌絲的生長，最高抑制率達100%，2.5%的發(fā)酵濾液能明顯導致稻瘟病病原菌菌絲膨大或異常扭曲、甚至自溶，5%～50%的發(fā)酵濾液能明顯抑制孢子的萌發(fā)，最高孢子萌發(fā)抑制率達74.27%。

關(guān)鍵詞：水稻稻瘟病；放線菌；根際微生物；抑菌活性

中圖分類號：Q939.95 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）09-0001-05

Screening and Identification of Antagonistic Actinomycete CZ133 Against Rice Blast and Analysis of Its Antimicrobial Activity

CAI Chang-ping，HUANG Jun，LEI Ping，GUO Zhao-hui，XIAO Rong，F(xiàn)U Zu-jiao，

LUO Rong-jun，HU Zhan

（Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC）

Abstract： Antagonistic actinomycetes with antimicrobial activity against rice blast were screened from rhizosphere soil samples of Hunan rice by plate confrontation method. Through the morphology observation of colonies and strains， the antagonistic actinomycetes were identified by 16S rDNA and gyrB gene sequences， and the effects of fermentation filtrate on mycelial growth and spore germination of rice blast pathogen were analyzed. The results showed that an antagonistic actinomycete CZ133 was isolated and purified， and its average inhibition rate to the pathogen of rice blast was 59.47%. It was identified as Streptomyces. The fermentation filtrate of the strain could significantly inhibit the growth of the pathogen， and the highest inhibition rate was 100%. 2.5% fermentation filtrate could obviously cause mycelium enlargement or abnormal distortion， even autolysis. 5%-50% fermentation filtrate could obviously inhibit spore germination， and the highest inhibition rate was 74.27%.

Key words： rice blast； actinomycetes； Rhizosphere microorganism； antagonistic activity

稻瘟?。≧ice blast）是水稻三大病害之一，難以防治。每年因稻瘟病導致的水稻產(chǎn)量損失約占總產(chǎn)量的10%～30%，產(chǎn)值高達數(shù)十億美元。特別是部分雜交水稻品種稻瘟病抗性弱，一旦發(fā)生稻瘟病，損失巨大。目前，稻瘟病主要依靠化學農(nóng)藥三環(huán)唑和稻瘟靈等進行防治。但化學農(nóng)藥的長期施用，不僅容易誘發(fā)稻瘟病病原菌產(chǎn)生變異，同時給生態(tài)環(huán)境造成威脅。尋找高效生物防治方法預防水稻稻瘟病是保證水稻安全生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要途徑之一。

研究顯示，存在于土壤、植物組織、甚至深海等逆境中的微生物，能合成豐富的抗菌代謝產(chǎn)物，是一種天然防治稻瘟病的潛在資源[1-2]。其中，細菌是報道最多的稻瘟病拮抗菌株，特別是枯草芽胞桿菌群的枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌，它們對稻瘟病的生物防效達到了63%～85%[3-7]。此外，放線菌是另一大類對稻瘟病具有較高預防潛能的微生物[8]。王真真等[9]、Xu等[10]從水稻組織中分離的鏈霉菌OsiRt-1、OsiRt-2對稻瘟病病原菌表現(xiàn)出較強的抑制作用，而張海霞等[11]、杜春梅等[12]、Boukaew等[13]從土壤中分離的鏈霉菌WM2-4、NK413、RM-1-138對稻瘟病病原菌的抑制效果分別達到89.35%、100%和88.73%。這些微生物在稻瘟病的生物防治中表現(xiàn)出一定的潛力。雖然已有很多的稻瘟病拮抗菌株被發(fā)現(xiàn)，并有少數(shù)菌株開始應用于稻瘟病的生物防治，但是由拮抗微生物制成的生物農(nóng)藥防效依然不能滿足市場的需求，繼續(xù)從不同來源篩選、尋找新型高效稻瘟病拮抗微生物仍很有必要。

筆者從湖南各個不同地區(qū)水稻根際土壤中分離純化到1株對稻瘟病菌具有高效抑制作用的拮抗放線菌，通過形態(tài)觀察、16S rDNA和gyrB基因序列分析對該菌株進行了鑒定，并通過活性分析該菌株對稻瘟病病原菌菌絲和孢子萌發(fā)的影響，以期為稻瘟病的生物防治提供新的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 拮抗菌株CZ133為湖南省微生物研究院生物防治研究小組從水稻根際土壤中分離純化得到；供試水稻稻瘟病病原菌TCYD1是該研究小組2016年從湖南益陽桃江水稻超優(yōu)一千染病植株上分離純化，用于拮抗試驗。

1.1.2 培養(yǎng)基 拮抗放線菌分離采用含苯菌靈（50 μg/mL）和萘啶酸（25 μg/mL）的PDA培養(yǎng)皿進行；發(fā)酵培養(yǎng)采用ISP2培養(yǎng)液[14]（麥芽浸膏1%，酵母提取物0.4%，葡萄糖0.4%，pH值7.2±0.2，瓊脂2.0%）；稻瘟病菌培養(yǎng)及抑菌試驗采用ISP2培養(yǎng)基；稻瘟病孢子培養(yǎng)采用燕麥培養(yǎng)基[15]（30 g燕麥片用純水煮沸1 h，4層紗布過濾除去沉淀，加入榨取的新鮮西紅柿汁100 mL，瓊脂粉15 g，純水定容至1 000 mL，pH值7.2±0.2）。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗放線菌的分離、純化及篩選 （1）拮抗放線菌的分離、純化。分別從湖南益陽、常德、岳陽、郴州等地的水稻根際采集土壤，稱取10 g于帶玻璃珠、且含90 mL無菌水的三角瓶內(nèi)，充分振蕩，30℃搖床培養(yǎng)4～5 h，靜止5～10 min，取0.5 mL上清至4.5 mL無菌水中，稀釋l0倍，重復稀釋至100倍、1 000倍。從100倍、1 000倍稀釋液中取100 μL涂PDA培養(yǎng)皿（含50 μg/mL苯菌靈和25 μg/mL的萘啶酸），28℃倒置培養(yǎng)1～2周。挑取菌落形態(tài)、顏色等培養(yǎng)或產(chǎn)孢性狀不同的放線菌單菌落畫線純化并保存。（2）抑菌試驗。采用平板對峙法[16]測定分離的放線菌對稻瘟病菌的抑菌活性。取新鮮的稻瘟病菌8.0 mm菌餅，接種于ISP2培養(yǎng)基平板中央，然后在距離菌餅中心3 cm處呈120°用無菌牙簽接種放線菌，設無菌處理為對照，每處理重復3次，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，測量菌落半徑，按公式（1）計算抑制率。

抑制率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100 （1）

1.2.2 拮抗放線菌鑒定 （1）培養(yǎng)性狀觀察。將篩選出的拮抗放線菌接種于ISP2、高氏1號和察氏培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，觀察其菌落形態(tài)、顏色、孢子顏色及是否產(chǎn)色素等。（2） 16S rDNA和gyrB基因序列分析鑒定。采用上海生物工程有限公司細菌總DNA提取試劑盒提取拮抗放線菌的基因組DNA。

1.2.3 拮抗菌株無菌發(fā)酵液對稻瘟病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響 （1）拮抗細菌無菌發(fā)酵液對稻瘟病菌菌絲生長的影響。挑選平板對峙試驗中抑菌率高的菌株，活化后接種于10 mL ISP2培養(yǎng)液中，28℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，10 000 r/min離心收集上清液，0.22 μm無菌濾膜過濾，獲得無菌發(fā)酵液。將無菌發(fā)酵液稀釋2、4、10、50、100倍，分別取原液和不同濃度液體各1 mL與9 mL冷卻至50℃的ISP2培養(yǎng)液混合，配置分別含無菌發(fā)酵液10%、5%、2.5%、1%、0.2%、0.1%濃度的培養(yǎng)基平板，然后在平板中央接種8.0 mm稻瘟病新鮮菌餅，每處理重復3次，以無菌水代替無菌發(fā)酵液為對照，28℃恒溫培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。（2）拮抗細菌無菌發(fā)酵液對稻瘟病菌菌絲的抑制作用。按上述方法制備含無菌發(fā)酵液0%、2.5%、5%的平板，并在平板中央接種稻瘟病新鮮菌餅，在菌餅外圍約2 mm、5 mm處斜插無菌蓋玻片，28℃恒溫培養(yǎng)5～10 d，取出生長了部分菌絲的蓋玻片在蔡司相差顯微鏡下觀察稻瘟病菌菌絲的生長情況。（3）拮抗細菌無菌發(fā)酵液對稻瘟病菌孢子萌發(fā)的影響。采用無菌水將保存在高粱粒上的稻瘟病孢子洗下來，取100 μL涂布在新鮮ISP2平板上，28℃培養(yǎng)3 d后，挑取單菌落接種至另一新鮮ISP2平板，28℃培養(yǎng)6 d后，挑取菌絲接種到燕麥培養(yǎng)基上，待平板上菌絲長滿后（約7～10 d），無菌條件下用刷子刷掉氣生菌絲，將平板置于28℃人工氣候培養(yǎng)箱光暗交替（14∶10 h）培養(yǎng)。待充分產(chǎn)孢（約3～4 d）后，每皿用5mL無菌水洗下孢子，用滅菌的擦鏡紙過濾后制成105濃度的孢子液[16]。在1.5 mL Ep管中將拮抗細菌的無菌發(fā)酵液按比例與稻瘟病菌孢子懸浮液（105個/mL）、無菌水混合，配制成5%、10%、20%、50%濃度的無菌發(fā)酵液，每個處理重復3次，以無菌水與孢子懸浮液混合為對照，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，采用顯微鏡在10×20倍鏡頭下檢測孢子萌發(fā)情況[18]，統(tǒng)計各處理孢子萌發(fā)率，按公式（2）計算孢子萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)抑制率（%）=（對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率×100 （2）

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌CZ133菌株的篩選

從湖南不同地區(qū)水稻根際土壤中分離純化到180株放線菌，根據(jù)形態(tài)學特征以及分類學特征去重復后，79株放線菌用于稻瘟病病原菌的抑制試驗。平板對峙試驗的結(jié)果顯示，有34株放線菌對稻瘟病病原菌具有明顯的抑菌效果，其中12株菌的抑菌率超過50%，10株菌抑菌率在40%～50%之間，9株抑菌率在30%～40%，3株菌的抑菌率在20%～30%。34株菌中，分離自郴州水稻根際土壤的CZ133菌株表現(xiàn)非常突出，3次不同時間進行的抑菌試驗顯示該菌株對稻瘟病菌絲的生長抑制率分別為57.72%、69.73%、50.96%，平均抑菌率59.47%。CZ133對稻瘟病病原菌的抑制效果如圖1所示。

2.2 CZ133菌株的形狀觀察

CZ133菌株在ISP2固體培養(yǎng)基上，菌落圓形，產(chǎn)白色菌絲，灰色孢子，早期菌落白色，后期黃色，最后變成黑褐色，菌落形狀如圖2所示。該菌株在高氏1號、察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)，氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲灰褐色，產(chǎn)灰綠色孢子。顯微鏡下觀察，CZ133菌株氣生菌絲分支較多，呈樹枝狀，無隔膜，孢子圓形或橢圓形（圖3）。

2.3 CZ133菌株的分子鑒定

以CZ133菌株的基因組DNA為模板，進行16S rDNA 27F-765R、704F-1492R兩段序列和gyrB基因序列的PCR擴增，分別獲得了預期的700、700和1 200 bp

大小的DNA片段。將16S rDNA的上下兩段700 bp片段連接，和gyrB基因進行Blast比對，采用Mega7.0

分別以16S rDNA、gyrB基因和16S rDNA-gyrB序列構(gòu)建鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4～6）。結(jié)合3個進化樹結(jié)果，CZ133菌株分屬于放線菌株鏈霉菌屬，與放線菌標準菌株天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）DSM 40233菌株和桑氏鏈霉菌（Streptomyces sampsonii）NBRC 13083相似性最高，同處一個分支。

2.4 CZ133菌株的抑菌活性分析

2.4.1 菌株CZ133無菌發(fā)酵液對稻瘟病病原菌菌絲生長的影響 試驗結(jié)果表明，CZ133菌株在ISP2培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，其無菌發(fā)酵液對稻瘟病菌具有明顯的拮抗作用。在含無菌發(fā)酵液的培養(yǎng)基上生長的稻瘟病菌被不同程度地抑制，其菌絲生長抑制水平與無菌發(fā)酵液濃度呈正相關(guān)（圖7、表1）。當采用含10%發(fā)酵濾液（相當于發(fā)酵液被稀釋10倍）的培養(yǎng)基培養(yǎng)稻瘟病病原菌時，病原菌菌絲的生長基本被完全抑制，而采用含0.1%發(fā)酵濾液（相當于發(fā)酵液稀釋1 000倍）的培養(yǎng)基培養(yǎng)稻瘟病病原菌時，其菌絲依然能被輕微抑制（表1）。

相差顯微鏡下觀察，CZ133菌株無菌發(fā)酵液濃度為2.5%、5.0%時能明顯延緩稻瘟病菌菌絲生長，促進菌絲膨大，導致菌絲異常扭曲甚至自溶（圖8），還

能阻止稻瘟病孢子的形成。

2.4.2 CZ133無菌發(fā)酵液對稻瘟病菌孢子萌發(fā)的影響 由表2可知，CZ133的無菌發(fā)酵液能抑制稻瘟病菌孢子的萌發(fā)，其抑制水平與發(fā)酵液濃度呈正相關(guān)，當無菌發(fā)酵液按50%的體積分數(shù)與稻瘟病孢子懸浮液混合培養(yǎng)16 h后，對孢子萌發(fā)抑制率達74.27%。

3 結(jié)論與討論

目前已發(fā)現(xiàn)對稻瘟病菌具有抗性的微生物大多為細菌[1，9，16]，放線菌作為大多數(shù)抗生素的來源菌株，是一種潛在的稻瘟病生防資源。研究從水稻根際土壤中分離篩選到一株對稻瘟病病原菌具有顯著抑菌活性的放線菌，通過菌落形態(tài)、16S rDNA和gyrB序列分析，明確該菌株為鏈霉菌屬。通過平板對峙和菌絲生長抑制試驗，發(fā)現(xiàn)該菌株的菌體和無菌發(fā)酵濾液均對稻瘟病病原菌菌絲有明顯抑制作用，最高抑制率達100%，發(fā)酵濾液稀釋1 000倍后仍有2.19%的抑菌率；孢子萌發(fā)試驗顯示，該菌株的無菌發(fā)酵濾液能顯著抑制稻瘟病病原菌孢子的萌發(fā)。CZ133菌株主要通過分泌代謝產(chǎn)物來抑菌，且作用途徑可能多樣，不僅能抑制稻瘟病病原菌菌絲的生長，還能抑制孢子的萌發(fā)。顯微鏡觀察結(jié)果顯示，該菌株可能通過誘發(fā)稻瘟病病原菌菌絲膨大、扭曲或畸變，阻止病原菌孢子形成和萌發(fā)等途徑而達到抑菌效果。此外，通過對稻瘟病菌不同生理小種的拮抗試驗，發(fā)現(xiàn)該菌株對大多數(shù)稻瘟病生理小種均表現(xiàn)出較好的抗性。CZ133菌株是一株抑菌活性較強且對稻瘟病具有較大應用范圍的生防放線菌，具有潛在的開發(fā)和應用價值。

參考文獻：

[1] Spence C，Alff E，Johnson C，et al. Natural rice rhizospheric microbes suppress rice blast infections [J]. BMC plant biology，2014，14：130.

[2] 靳西彪. 海洋中稻瘟病拮抗菌的分離、發(fā)酵優(yōu)化及其活性成分分析[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2012.

[3] Saikia R L，Gogoi D K，Mazumder S，et al. Brevibacillus laterosporus strain BPM3， a potential biocontrol agent isolated from a natural hot water spring of Assam， India[J]. Microbiology research，2011，166（3）：216-225.

[4] Suryadi Y，Susilowati D N，Riana E，et al. Management of rice blast disease （Pyricularia oryzae）using formulated bacterial consortium[J]. Emirates journal of food and agriculture，2013，25（5）：349-357.

[5] 張 芬，劉郵洲，于俊杰，等. 水稻稻瘟病菌拮抗細菌的篩選與鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2011，27（3）：505-509.

[6] Meng X K，Yu J J，Yu M N，et al. Dry flowable formulations of antagonistic Bacillus subtilis strain T429 by spray drying to control rice blast disease[J]. Biological Control，2015，85：46-51.

[7] 沙月霞，王 琦，李 燕. 稻瘟病生防芽胞桿菌的篩選及防治效果[J]. 中國生物防治學報，2016，32（4）：474-484.

[8] Law J W，Ser H L，Khan T M，et al. The potential of Streptomyces as biocontrol agents against the rice blast fungus， Magnaporthe oryzae（Pyricularia_oryzae）[J]. Frontiers in microbiology，2017，8：3.

[9] 王真真，徐 婷，袁珊珊，等. 水稻內(nèi)生放線菌OsiRt-1的分離鑒定

及對稻瘟病的防治作用[J]. 微生物學通報，2016，43（5）：1009-1018.

[10] Xu T，Li Y，Zeng X，et al. Isolation and evaluation of endophytic Streptomyces endus OsiSh-2 with potential application for biocontrol of rice blast disease[J]. Journal of the science of food and agriculture，2017，97（4）：1149-1157.

[11] 張海霞，王彥杰，孫冬梅，等. 一株拮抗稻瘟病菌的放線菌篩選及初步鑒定[J]. 黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2010，22（2）：15-19.

[12] 杜春梅，宋 剛，趙 丹，等. 稻瘟病拮抗菌NK413的鑒定及抑菌效果[J]. 植物保護，2010，36（6）：77-81.

[13] Boukaew S，Prasertsan P. Suppression of rice sheath blight disease using a heat stable culture filtrate from Streptomyces philanthi RM-1-138[J]. Crop protection，2014，61：1-10.

[14] Landy M，Warren G H，Roseman S B，et al. Bacillomycin，an antibiotic from Bacillus subtilis active against pathogenic fungi[J]. Proceedings of the society for experimental biology and medicine，1948，67：539-541.

[15] Kim H J，Lee S C，Hwang B K. Streptomyces cheonanensis sp. Nov.，a novel streptomycete with antifungal activity[J]. International journal of systematic and evolutionary microbiology，2006，56：471-475.

[16] 金 鑫. 稻瘟病生防菌Afl、Af4的初步研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2010.

[17] Guo Y，Zheng W，Rong X，et al. A multilocus phylogeny of the Streptomyces griseus 16S rRNA gene clade： use of multilocus sequence analysis for streptomycete systematics[J]. International journal of systematic and evolutionary microbiology，2008，58（1）：149-159.

[18] Skamnioti P，Gurr S J. Against the grain： safeguarding rice from rice blast disease[J]. Trends in biotechnology，2009，27（3）：141-150.

（責任編輯：夏亞男）