高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定玉米中AFB1和三種除草劑

■李洪波 宋志超 吳寧鵬* 黃志偉 劉利曉

（1.駐馬店市畜牧局，河南駐馬店 463000；2.河南省獸藥監(jiān)察所，河南鄭州450008）

玉米是全世界產(chǎn)量最高的糧食作物，也是重要的飼料原料。然而玉米在種植、儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中極易受到多種霉菌的感染，在適宜的環(huán)境中就會(huì)產(chǎn)生大量的霉菌毒素，其中最主要的是黃曲霉毒素B1（AFB1）。AFB1是由黃曲霉的多種菌株通過聚酮途徑產(chǎn)生的二呋喃香豆素的衍生物。玉米、花生、棉籽以及餅粕最易被AFB1污染，小麥、高粱和甘薯次之，豆粕被AFB1污染的程度較輕[1]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organisation，F(xiàn)AO）估計(jì)全球約25%的糧食作物被AFB1污染[2]。被廣泛污染的食品、飼料等植物性產(chǎn)品已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）列為食源性疾病的重要根源[3]。高秀芬等(2011)對(duì)中國(guó)部分地區(qū)玉米中4種AF污染調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，所測(cè)定的279份玉米樣品，AF陽性率為75.63%,陽性樣品平均濃度為44.04 μg/kg。四川、湖北、廣西、河南、廣東和吉林各省樣品的陽性率依次為90.48%、93.75%、87.50%、36.96%、91.84%和52.17%。由此可以看出玉米的AF污染比較普遍，且以AFB1為主[4]。AFB1的檢測(cè)方法種類很多，目前已經(jīng)建立起來的檢測(cè)方法主要有：酶聯(lián)免疫法[5]、薄層色譜、液相色譜法[6-7]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8]。影響玉米質(zhì)量安全的另一因素是農(nóng)藥殘留。為了保證玉米的產(chǎn)量，大量的殺蟲劑和除草劑在種植過程中使用，造成的殘留問題已引起廣泛關(guān)注。近年來，我國(guó)對(duì)農(nóng)藥的需求量顯著增加。其中，除草劑的增長(zhǎng)率遠(yuǎn)高于殺蟲劑和殺菌劑的發(fā)展水平，約占到農(nóng)藥產(chǎn)量比重的1/3[9]。不可否認(rèn)，除草劑的使用提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的效率，但其除草劑殘留對(duì)農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的污染也日益嚴(yán)重。目前農(nóng)藥除草劑常用的檢測(cè)方法主要有：酶聯(lián)免疫法、色譜分析法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]。國(guó)內(nèi)殘留限量中食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定玉米中AFB1的限量為20 μg/kg，飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定玉米中AFB1的含量應(yīng)小于40 μg/kg。我國(guó)制定的玉米中甲草胺的最大殘留限量為0.2 mg/kg，乙草胺為0.05 mg/kg，丁草胺為0.5 mg/kg；歐盟法規(guī)（EC）No1525/98規(guī)定AF總量不超過4 μg/kg[13-15]。因此建立同步、高效、高靈敏檢測(cè)玉米中AFB1和農(nóng)藥殘留的新方法對(duì)于保障玉米及飼料質(zhì)量安全具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 儀器

Acquit UPLC-Xevo TQ-S質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters公司）；3-30k臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；TTLDCⅡ氮吹儀（北京同泰科技發(fā)展有限公司）；IKAMS3.Basic圓周振蕩器（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；AG125電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；VX-Ⅲ多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；Plexa固相萃取柱(安捷倫公司)。

1.2 試劑

甲醇、乙腈均為色譜純(德國(guó)默克)，甲酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），正己烷為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司），微孔濾頭（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)mili-Q凈化系統(tǒng)制備的去離子水；對(duì)照品：AFB1購(gòu)于Pribolab公司，甲草胺、乙草胺和丁草胺均購(gòu)于上海市農(nóng)藥研究所有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：將AFB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（標(biāo)示量1.0 mg）用甲醇轉(zhuǎn)移并定容至10 ml容量瓶中，制成100 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密稱取甲草胺、乙草胺和丁草胺各10 mg于100 ml容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，制成100 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制：精密量取AFB1、甲草胺、乙草胺、丁草胺各0.1 ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋、定容，制成1.0 μg/ml混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

以上標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于-20℃避光保存；混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于4℃避光保存。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取

稱取制備玉米樣品（2.00±0.05）g于50 ml聚四氟乙烯離心管中，加入90%乙腈溶液10 ml，置于超聲波中超聲20 min，中間振蕩兩次，取出后6 000 r/min離心5 min，倒出上清液于另一50 ml離心管中。重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，準(zhǔn)確量取上清液5 ml于10 ml離心管中，50℃氮?dú)獯抵良s0.5 ml，加5%甲醇溶液5 ml，渦旋混勻，待凈化。

1.4.2 樣品凈化

Plexa固相萃取柱依次用5 ml甲醇、5 ml水活化，待凈化液全部過柱，流速不超過1.0 ml/min，用5 ml 5%甲醇淋洗，吹干。用5 ml甲醇洗脫至10 ml離心管中，洗脫液于50℃氮?dú)獯蹈?，殘余物?5%乙腈（含0.1%甲酸）1.0 ml溶解，用流動(dòng)相稀釋5倍后過0.22 μm微孔濾頭，供超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.5 方法

1.5.1 色譜條件

流動(dòng)相：乙腈和0.1%甲酸水，色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18（1.7 μm，2.1×100 mm），柱溫：35 ℃，流速：0.4 ml/min，進(jìn)樣量：5 μl，梯度洗脫條件見表1。

表1 色譜梯度洗脫程序

1.5.2 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧正離子模式（ESI+）；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；毛細(xì)管電壓：0.6 kV；離子源溫度：150℃；去溶劑溫度：500℃；錐孔氣體流速：150 L/Hr；去溶劑氣體流速：1 000 L/Hr；碰撞氣體流速：0.15 ml/min；監(jiān)測(cè)定性、定量離子對(duì)見表2。

表2 AFB1、甲草胺、乙草胺和丁草胺的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[16-17]和AFB1、甲草胺、乙草胺和丁草胺的化合物易結(jié)合H+的結(jié)構(gòu)特征，選擇ESI+模式進(jìn)行檢測(cè)。分別將各組分化合物配制成0.1 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀在待機(jī)狀態(tài)下，用乙腈/0.1%甲酸水（50/50）的流動(dòng)相、0.4 ml/min流速與10 μl/min流速的0.1 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液聯(lián)合進(jìn)樣。儀器自動(dòng)調(diào)諧，在一級(jí)質(zhì)譜中掃描各組分的母離子，在二級(jí)質(zhì)譜中，母離子在碰撞池經(jīng)高純氬氣碰撞后生成不同質(zhì)荷比的子離子，并優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)。得到子離子中，選擇兩個(gè)豐度較大的子離子作為定性離子；在兩個(gè)定性離子中選擇豐度最大的一個(gè)作為定量離子。從而確定質(zhì)譜條件和調(diào)諧參數(shù)。

超高效液相色譜質(zhì)譜中的ESI+模式對(duì)流動(dòng)相要求較高，流動(dòng)相不僅影響各組分的相對(duì)保留時(shí)間和峰形，還影響各組分的質(zhì)子化效率。因此應(yīng)選擇合理的流動(dòng)相組成，配合最佳的梯度洗脫程序，從而提高各組分的響應(yīng)值和分離度。為提高各組分的質(zhì)子化效率，固定水相中加入0.1%甲酸。由于各組分在不同的通道，因此本文不將流動(dòng)相對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響作為考察重點(diǎn)，而重點(diǎn)考察流動(dòng)相對(duì)質(zhì)子化效率和峰形的影響。有機(jī)相分別選擇乙腈、甲醇和乙腈/甲醇（50/50），通過試驗(yàn)最終選擇乙腈/0.1%甲酸在表1梯度條件下得到的峰形和響應(yīng)值最好。在此色譜質(zhì)譜條件下得到的各組分離子流圖見圖1。

圖1 AFB1、甲草胺、乙草胺和丁草胺的離子流圖

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18-19]，檢測(cè)AFB1和甲草胺等農(nóng)藥殘留的提取溶劑多為乙腈、甲醇、丙酮等，樣品經(jīng)溶劑提取后固相萃取柱進(jìn)一步凈化。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道傾向于使用乙腈作為提取溶劑，乙腈不但提取效果好，而且可以沉淀蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，溶出雜質(zhì)較少，因此選擇乙腈作為提取溶劑，為了既保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，又盡可能減少有機(jī)試劑的使用，對(duì)不同比例的乙腈水作為溶劑進(jìn)行考察；本文分別考察了60%乙腈、80%乙腈、90%乙腈和純乙腈作為提取溶劑的提取效果。由圖2可以看出90%乙腈和純乙腈作為提取溶劑AFB1和甲草胺等農(nóng)藥殘留的回收率相對(duì)較高，為在保證檢測(cè)準(zhǔn)確度的前提下減少有機(jī)試劑的使用，因此確定采用90%乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同比例乙腈水提取后的回收率

根據(jù)AFB1、甲草胺等農(nóng)藥的化學(xué)性質(zhì)，選擇OasisHLB柱、Cleanert PEP-SPE柱和Bond Elut Plexa作為考察對(duì)象，按照各固相萃取小柱的使用說明進(jìn)行樣品凈化步驟的操作。以所得樣品的回收率為指標(biāo)考察各固相萃取柱的凈化后的效果，結(jié)果見圖3。由此可見Bond Elut Plexa柱對(duì)AFB1、甲草胺等農(nóng)藥殘留的凈化效果最好。

圖3 三種固相萃取柱凈化后的回收率

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

分別準(zhǔn)確量取AFB1、甲草胺、乙草胺、丁草胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用35%乙腈（含0.1%甲酸）作為稀釋溶液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，配制成AFB1的濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/ml，丁草胺的濃度為 2、5、10、20、50 ng/ml，甲草胺、乙草胺的濃度為10、20、50、100、200 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)行測(cè)定，以得到的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用35%乙腈（含0.1%甲酸）按一定的比例逐級(jí)稀釋，在“1.5.1”與“1.5.2”所述的色譜質(zhì)譜條件下測(cè)定，計(jì)算每個(gè)濃度下的信噪比，并由此推算，當(dāng)S/N=3時(shí)樣品的濃度即為本方法的檢測(cè)限（LOD）；當(dāng)S/N=10時(shí)樣品的濃度即為本方法的定量限（LOQ）。標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限結(jié)果見表3，結(jié)果表明各目標(biāo)化合物在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表3 AFB1、甲草胺、乙草胺和丁草胺的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 方法回收率和精密度

在空白基質(zhì)樣品中添加3個(gè)不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.4”和“1.5”中的試驗(yàn)方法進(jìn)行提取、凈化和測(cè)定。每個(gè)濃度水平重復(fù)5次，計(jì)算3個(gè)水平的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果見表4。由表4可見，AFB1、甲草胺、乙草胺和丁草胺的加標(biāo)回收率在74.7%～102.1%之間，RSD值在1.2%～4.2%之間。由此可見該實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠，可以滿足實(shí)際樣品檢測(cè)分析的要求。

表4 空白玉米樣品加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用建立的玉米中AFB1、甲草胺、乙草胺和丁草胺同步檢測(cè)新方法對(duì)從河南省不同飼料企業(yè)，不同產(chǎn)地的玉米樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果所測(cè)定的30批樣品中，AFB1檢出3批，含量分別為6.8、12.4、51.3 μg/kg；農(nóng)藥殘留甲草胺、丁草胺各檢出1批，含量均未超定量限，乙草胺全部未檢出。由檢測(cè)結(jié)果可知，目前玉米有不同程度的AFB1的污染，受農(nóng)藥殘留的影響較小，因此，玉米中AFB1污染問題將成為我們今后關(guān)注的焦點(diǎn)，玉米中AFB1污染的防治與檢測(cè)將是我們以后工作的重點(diǎn)。

3 結(jié)論

通過對(duì)前處理方法的優(yōu)化和對(duì)色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同步檢測(cè)AFB1和三種除草劑農(nóng)藥殘留的新方法。本方法準(zhǔn)確、靈敏、操作簡(jiǎn)便，可用于玉米中AFB1和三種除草劑的檢測(cè)，為全面保障玉米產(chǎn)品質(zhì)量提供新的技術(shù)支撐。