紫外-微波誘變選育抗菌肽高產(chǎn)菌株及抗菌肽性質(zhì)分析

■朱永明 董偉潔 姜軍坡王世英 朱寶成

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001）

微生物源抗菌肽是由微生物分泌的可殺滅或抑制其他細(xì)菌、真菌的小分子多肽，相對分子質(zhì)量一般介于2 000～7 000 Da之間[1]?？咕木哂袩o殘留、無毒害、無耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，適合應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)[2-3]。

對微生物進(jìn)行誘變選育是提高微生物胞外產(chǎn)物產(chǎn)量的一種有效方法。杜康等[4]對巴氏芽孢桿菌YBB進(jìn)行微波誘變，篩選出兩株產(chǎn)脲酶更高的突變菌株，誘變菌株尿素分解能力較原菌株提高1.5倍左右，礦化能力提高114%；郭宏文等[5]對產(chǎn)異淀粉酶的黃桿菌菌株D15進(jìn)行紫外線誘變處理，獲得了1株產(chǎn)異淀粉酶活力較高且產(chǎn)酶穩(wěn)定的菌株ZYF32，比出發(fā)菌株提高了3.23倍；秦艷飛等[6]經(jīng)紫外-微波復(fù)合誘變，獲得1株P(guān)UM-13菌株，使那西肽搖瓶產(chǎn)量達(dá)883.450 μg/ml，比出發(fā)菌株的產(chǎn)量提高了17.14%。

Bacillus velezensisTu-569菌株是本研究組從幼兔腸道中分離出的一株對大腸桿菌有抑菌活性的芽孢桿菌[7]。向斷奶仔兔日糧中添加Tu-569菌株制備的菌劑，可改善斷奶仔兔的生產(chǎn)性能，降低幼兔腹瀉率和死亡率[8]。本研究擬以抑制大腸桿菌能力為指標(biāo)，對Tu-569菌株進(jìn)行紫外-微波誘變選育，并以遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)評價正突變菌株的穩(wěn)定性，以獲得抑菌能力更強(qiáng)、遺傳更穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株；通過觀察高產(chǎn)菌株的菌落和菌體形態(tài)，以生理生化試驗(yàn)和API 50 CH細(xì)菌鑒定條綜合評測高產(chǎn)菌株生理生化特性，結(jié)合16S rDNA序列分析來鑒定高產(chǎn)菌株的種屬；通過考察硫酸銨鹽析、透析處理、蛋白酶處理、加熱處理、緩沖液pH值等對突變菌株胞外產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響，探索抑菌物質(zhì)的性質(zhì)，為將其開發(fā)為抗菌肽制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌種：Tu-569（Bacillus velezensis），由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

指示菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）ETEC-44155，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系實(shí)驗(yàn)室保存。

API 50 CH細(xì)菌鑒定條，由法國生物梅里埃公司生產(chǎn)。

NB培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基的組成參考文獻(xiàn)[9]，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成參考尚偉(2012)[7]。

生理生化特性試驗(yàn)所用試液的配制參考文獻(xiàn)[10]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Tu-569菌株生長曲線的繪制

從Bacillus velezensisTu-569菌株斜面上挑取部分菌苔，接種于NB培養(yǎng)基中，裝瓶量為50 ml/250 ml，于37℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，即得種子液。

按2%的接種量向裝瓶量為50 ml/250 ml的NB培養(yǎng)基中接入種子液，于37℃、180 r/min培養(yǎng)；每隔3 h取樣一次，以NB培養(yǎng)基為空白對照，測定600 nm下的OD值并繪制Tu-569菌株的生長曲線。

1.2.2 Tu-569菌株的紫外誘變選育

1.2.2.1 菌懸液的制備

將50 ml Tu-569菌株的種子液加入100 ml離心管中，9 000 r/min離心6 min，收集菌體。用無菌生理鹽水洗滌2次，再向菌體中加入適量的生理鹽水，振蕩，配制成濃度為108CFU/ml的菌懸液，備用。

1.2.2.2 紫外誘變處理

取無菌平皿（內(nèi)徑為9 cm），加入上述菌懸液5 ml，然后放入磁力攪拌子，置于磁力攪拌器上。將紫外燈（20 W）預(yù)熱30 min后，進(jìn)行不同時間（0～360 s）的紫外照射，照射距離為30 cm，每隔60 s取樣一次。將上述誘變處理后的菌懸液稀釋至10-6后涂NA平板；注意避光操作。以未經(jīng)紫外線處理的菌液作為對照，稀釋至10-6后涂NA平板。將上述NA平板置37℃培養(yǎng)；處理組NA平板需避光培養(yǎng)；24 h后觀察菌株生長情況，并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算致死率，繪制致死率曲線。

致死率(%)=（對照原菌液中的活菌數(shù)-處理后菌液中的活菌數(shù)）/對照原菌液中的活菌數(shù)×100。

1.2.2.3 初篩

大腸桿菌平板的制備方法參考文獻(xiàn)[11]。挑取處理組NA平板上生長的菌落轉(zhuǎn)接于E.coli平板，培養(yǎng)24 h，測量菌落直徑和抑菌圈直徑，并以后者與前者之比計(jì)算圈徑比；將產(chǎn)生抑菌圈的菌株保存于NA斜面。在同一E.coli平板上同法測量Tu-569菌株產(chǎn)生的圈徑比；以Tu-569菌株對應(yīng)圈徑比為基準(zhǔn)，選取比其更大者作為復(fù)篩菌株。

1.2.2.4 復(fù)篩

將復(fù)篩菌株和Tu-569菌株分別接種于裝瓶量50 ml/250 ml的NB培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min培養(yǎng)12 h作為種子液。將種子液按2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝瓶量為50 ml/250 ml，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，即得發(fā)酵液。取發(fā)酵液10 000 r/min離心20 min，取上清液待用。以瓊脂打孔擴(kuò)散法[12]測定各菌株發(fā)酵液的抑菌活性。選取比Tu-569菌株抑菌活性更大的菌株，作為正突變菌株，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的測定。

1.2.2.5 突變菌株遺傳穩(wěn)定性的測定

將正突變菌株與Tu-569菌株同時于NA斜面上連續(xù)傳代10次；利用瓊脂打孔擴(kuò)散法測定各代菌株的抑菌活性，以抑菌活性為指標(biāo)來評價正突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.3 微波誘變選育高產(chǎn)菌株

以紫外誘變獲得的正突變菌株中遺傳最穩(wěn)定且活性較高者參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行微波誘變。制備該菌株的菌懸液，用無菌生理鹽水將其稀釋至10-6；吸取500 μl加入1.5 ml的EP管內(nèi)。設(shè)置微波爐參數(shù)為P50，每次微波輻射EP管（于碎冰盒中進(jìn)行冰?。?0 s。進(jìn)行不同次數(shù)（1～10次）的微波輻射。每次輻射均使用新制碎冰，以減少微波熱效應(yīng)引起的菌體死亡。誘變結(jié)束后，吸取100 μl均勻涂布于NA平板上，于37℃靜置培養(yǎng)24 h。觀察菌株生長情況，并統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算致死率，繪制致死率曲線。

按1.2.2.3、1.2.2.4節(jié)和1.2.2.5節(jié)的方法對NA平板上的菌株進(jìn)行初篩、復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性評價。以其中遺傳穩(wěn)定性最佳且抑菌活性較高者作為高產(chǎn)菌株。

1.2.4 高產(chǎn)菌株的鑒定

1.2.4.1 菌落和菌體形態(tài)觀察

將高產(chǎn)菌株劃線接種于NA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的大小、表面、邊緣、透明度、隆起形狀等形態(tài)特征。以革蘭氏染色法觀察菌體形態(tài)和芽孢形態(tài)。

1.2.4.2 生理生化特性測定

生理生化特性試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[10]中相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。

分別將Tu-569和高產(chǎn)菌株接種于API 50 CH細(xì)菌鑒定條上，37℃孵育24 h，觀察顏色變化，以確定對不同碳源的利用情況。

1.2.4.3 16S rDNA序列分析

參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行高產(chǎn)菌株總DNA的提取，并進(jìn)行16S rDNA的擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物送華大基因測序，將所測出的16S rDNA序列提交到GenBank中進(jìn)行BLAST比對，選取相似性較高的模式菌株序列，利用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 高產(chǎn)菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)的性質(zhì)研究

1.2.5.1 硫酸銨鹽析抑菌物質(zhì)的效果

按1.2.2.4節(jié)的方法制備發(fā)酵上清液。分別向100.0 ml發(fā)酵上清液中加入硫酸銨，使其達(dá)到不同的飽和度，并將其4℃靜置過夜后，于10 000 r/min離心20 min，可得上清液和沉淀。所得沉淀用10.0 ml的Tris-HCl（pH值7.4）溶液溶解，即得溶解物。采用瓊脂打孔擴(kuò)散法測定溶解物和上清液抑制大腸桿菌的活性。

1.2.5.2 透析處理鹽析沉淀的效果

將截留分子量為3.5 kDa和8.0 kDa的透析袋剪成適當(dāng)長度(15 cm左右）。8.0 kDa透析袋使用前需在含有2%（W/V）碳酸氫鈉和1 mmol/l EDTA（pH值8.0）的溶液中加熱煮沸10 min；用蒸餾水將其清洗3次；再在1 mmol/l EDTA（pH值8.0）中煮沸10 min。3.5 kDa透析袋使用前只需于蒸餾水中煮沸10 min即可。

按1.2.5.1節(jié)中方法制備70%飽和度硫酸銨鹽析對應(yīng)的溶解物，作為處理液，取20 ml轉(zhuǎn)移至透析袋中。在透析試驗(yàn)的整個過程中，透析袋始終浸沒在溶液中，取透析袋的時候必須戴手套。將處理液加入透析袋中透析24 h；前4 h每隔1 h更換ddH2O 1次；之后4～6 h換ddH2O 1次，以徹底除去硫酸銨。透析完成后，測量透析袋內(nèi)截留液的體積；以透析前加入處理液的體積為基準(zhǔn)，計(jì)算截留液體積增大的倍數(shù)，作為稀釋倍數(shù)。按相同的稀釋倍數(shù)稀釋處理液，作為同比稀釋液。測定處理液、截留液和同比稀釋液的抑菌活性。

1.2.5.3 蛋白酶處理對抑菌物質(zhì)活性的影響

將胰蛋白酶和胃蛋白酶分別用pH值8.0和pH值2.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制成10 000 U/ml的溶液，并依次稀釋成1 000、100 U/ml的蛋白酶溶液。在3個不同的1.5 ml EP管中先加入500 μl按1.2.5.1節(jié)中方法制備的70%飽和度硫酸銨鹽析對應(yīng)的溶解物，再加入500 μl蛋白酶溶液，使其終濃度達(dá)到5 000、500、50 U/ml。37 ℃孵育不同時間（30、60、90 min和120 min）后，分別加入500 μl酶反應(yīng)終止液，混合均勻，即得酶解液。

除以500 μl水代替500 μl蛋白酶溶液外，其余同上述操作，所得溶液作為陽性對照液。

除以500 μl水代替500 μl溶解物外，其余同上述操作，所得溶液作為陰性對照液。

以瓊脂打孔擴(kuò)散法測定陽性對照液、陰性對照液和酶解液的抑菌圈面積；不同濃度酶解液的抑菌圈面積與相應(yīng)陰性對照之差即為抑菌物質(zhì)在該濃度酶解液對應(yīng)的抑菌活性。

1.2.5.4 pH值對抑菌物質(zhì)活性的影響

取500 μl按1.2.5.1節(jié)中方法制備的70%飽和度硫酸銨鹽析對應(yīng)的溶解物，加入1.5 ml EP管中，再按1∶1體積分別加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），混合均勻后，4℃靜置1 h，作為處理液。以相應(yīng)pH值的磷酸-檸檬酸緩沖液代替溶解物作為陰性對照；以蒸餾水代替磷酸-檸檬酸緩沖液作為陽性對照。以瓊脂打孔擴(kuò)散法測定處理液、陰性對照、陽性對照的抑菌圈面積；處理液的抑菌圈面積與相應(yīng)陰性對照之差即為抑菌物質(zhì)在該pH值下對應(yīng)的抑菌活性。

1.2.5.5 加熱處理對抑菌物質(zhì)活性的影響

取1 ml按1.2.5.1節(jié)中方法制備的70%飽和度硫酸銨鹽析對應(yīng)的溶解物，分別在40、60、80、100℃和121℃下加熱處理30、60 min，然后立即放入碎冰盒中冷卻，靜置1 h后即得處理液。采用瓊脂打孔擴(kuò)散法測定處理液抑菌活性，以未處理的溶解物作為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tu-569菌株的生長曲線

Tu-569菌株的生長曲線如圖1所示。由圖1可知，0～6 h為延滯期；7～15 h為對數(shù)期，此時菌體生長旺盛；16～25 h為穩(wěn)定期；26 h后進(jìn)入衰亡期。誘變一般選擇對數(shù)生長期中后期，這時菌體生長速度快，因此選用種齡12 h的種子液進(jìn)行誘變選育。

2.2 Tu-569菌株的紫外誘變結(jié)果

由圖2可知，隨著紫外線照射時間的增加，Tu-569菌株的致死率逐漸增大，360 s時致死率達(dá)到100%。紫外線照射180 s時，致死率為63.3%；紫外線照射240 s時，致死率達(dá)到81.2%；紫外線照射300 s時，致死率為95.7%。一般認(rèn)為當(dāng)致死率在80%～90%之間時，菌株的變異正突變概率大且可以穩(wěn)定遺傳[15]。因此，選擇紫外線照射時間為240 s時的菌株進(jìn)行初篩。

圖1 Tu-569菌株的生長曲線

圖2 紫外誘變的致死率曲線

Tu-569菌株紫外誘變的初篩、復(fù)篩結(jié)果見表1。從結(jié)果可知，初篩得到9株圈徑比大于原菌株Tu-569的正突變菌株，其中T-4M-5突變株的圈徑比最大，達(dá)到2.20。復(fù)篩時，T-4M-5、T-4M-26、T-4M-11突變株的抑菌圈面積較大，分別是原菌株的1.79、1.69、1.61倍。

表1 Tu-569菌株紫外誘變初篩、復(fù)篩結(jié)果

T-4M-5、T-4M-11、T-4M-26突變株的遺傳穩(wěn)定性結(jié)果見表2。連續(xù)傳代10次后，T-4M-5、T-4M-11、T-4M-26突變株抑菌圈面積較第一代分別降低了4.0%、20.8%、24.0%，說明T-4M-11、T-4M-26遺傳穩(wěn)定性較差，而T-4M-5菌株遺傳穩(wěn)定性良好。故選擇T-4M-5菌株進(jìn)行微波誘變。

表2 突變菌株遺傳穩(wěn)定性結(jié)果

2.3 微波誘變選育高產(chǎn)菌株

用微波誘變T-4M-5菌株的致死率曲線如圖3所示。隨著處理時間的增加，致死率逐漸升高；在微波輻照30～70 s范圍內(nèi)，致死率上升較快；微波處理50 s時，致死率為62.6%；微波處理60 s時，致死率為78.2%；當(dāng)微波處理70 s時，致死率為85.2%；當(dāng)微波處理90 s時，致死率達(dá)到100%。選擇微波處理60 s和70 s的菌株進(jìn)行初篩。

圖3 T-4M-5菌株微波誘變致死率曲線

T-4M-5菌株微波誘變的初篩、復(fù)篩結(jié)果見表3。篩選出12株圈徑比較大的突變菌株，其中T-70-1突變株的圈徑比最大，達(dá)到3.10。經(jīng)復(fù)篩后T-70-1、T-70-2、T-70-3、T-60-5突變株的抑菌圈面積分別是出發(fā)菌株的1.53倍、1.34倍、1.47倍、1.33倍。

表3 T-4M-5菌株微波誘變初篩、復(fù)篩結(jié)果

將T-70-1、T-70-2、T-70-3、T-60-5突變株的遺傳穩(wěn)定性結(jié)果見表2。連續(xù)傳代十次后，T-70-1、T-70-2、T-70-3、T-60-5突變株抑菌效果分別降低了5.6%、5.1%、9.8%、7.4%，說明這四株菌遺傳穩(wěn)定性較好，其中T-70-1菌株的抑菌圈面積最大，達(dá)到343.3 mm2。因此選擇T-70-1菌株作為高產(chǎn)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4 高產(chǎn)菌株的鑒定

2.4.1 高產(chǎn)菌株的菌體形態(tài)與菌落形態(tài)

高產(chǎn)菌株T-70-1的菌落、菌體形態(tài)如圖4所示。由結(jié)果可知，T-70-1菌株菌落呈乳白色，近圓形，培養(yǎng)后期邊緣突出呈火山口狀，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密難挑取，質(zhì)地黏稠。T-70-1菌株的革蘭氏染色呈陽性，菌體為桿狀，芽孢中生。與原菌株Tu-569相比，無差別。

圖4 T-70-1菌株的菌落與菌體形態(tài)

2.4.2 高產(chǎn)菌株的生理生化試驗(yàn)

原菌株Tu-569和高產(chǎn)菌株T-70-1的生理生化特性測定結(jié)果見表4和圖5。由表4可知，兩菌株有以下不同之處：T-70-1菌株不產(chǎn)接觸酶，而Tu-569菌株產(chǎn)接觸酶；T-70-1菌株可在含10%、15%NaCl的培養(yǎng)基中生長，而Tu-569菌株不能。除此之外的生理生化特性，兩菌株相同。由圖5可知，T-70-1菌株可利用D-半乳糖（10）和D-塔格糖（42）生長，而Tu-569菌株不能。兩菌株都可利用淀粉、肌醇、D-果糖等24種碳源；都不能利用D-阿拉伯糖、L-山梨糖、L-鼠李糖等23種碳源。依據(jù)T-70-1菌株的生理生化特性，可將其歸為芽孢桿菌屬。

表4 Tu-569菌株和T-70-1菌株的生理生化試驗(yàn)對比

圖5 24 h API 50試紙條顏色反應(yīng)結(jié)果

2.4.3 高產(chǎn)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

高產(chǎn)菌株的16S rDNA序列相似性分析結(jié)果見表5，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6。供試菌株T-70-1與15株模式菌株的16S rDNA序列的相似度均高于90%，其中T-70-1菌株與Bacillus velezensis模式菌株CR-502的16S rDNA序列的相似性最高，達(dá)到99.93%。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，T-70-1菌株與Bacillus velezensis的同源性最高。故初步鑒定T-70-1菌株為Bacillus velezensis。

2.5 高產(chǎn)菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)的性質(zhì)分析

2.5.1 硫酸銨鹽析抑菌物質(zhì)的結(jié)果

不同飽和度硫酸銨鹽析T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)的結(jié)果見圖7。由結(jié)果可知，在30%～70%的硫酸銨飽和度范圍內(nèi)，隨著硫酸銨飽和度的增加，溶解物的抑菌活性逐漸增大；當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到70%時，抑菌活性最大，抑菌圈面積為361.7 mm2；在70%～100%的硫酸銨飽和度范圍內(nèi)，隨著硫酸銨飽和度的增加，溶解物的抑菌活性稍有波動，但是差異不顯著（P＞0.05）。故選取70%硫酸銨飽和度為沉淀抑菌物質(zhì)的最佳飽和度。

表5 高產(chǎn)菌株T-70-1的16S rDNA序列的相似性分析結(jié)果

圖6 高產(chǎn)菌株T-70-1的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 硫酸銨飽和度對鹽析后抑菌物質(zhì)活性的影響

2.5.2 透析袋截留分子量對截留液活性的影響

采用截留分子量為3.5、8.0 kDa的透析袋處理菌株硫酸銨鹽析溶解物的結(jié)果見圖8，硫酸銨溶解物經(jīng)3.5 kDa透析袋透析處理后，截留液仍具有抑菌活性，其對應(yīng)的抑菌圈面積為稀釋液的81.6%；8.0 kDa透析袋的截留液沒有形成抑菌圈，無抑菌活性。故采用3.5 kDa透析袋可有效截留T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)，推測其相對分子質(zhì)量在3.5～8.0 kDa之間。

2.5.3 蛋白酶處理對抑菌物質(zhì)活性的影響

胰蛋白酶對T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響見圖9。由結(jié)果可知，在50～5 000 U/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著胰蛋白酶酶活力的增加，在相同反應(yīng)時間下，酶活力越高，則抑菌物質(zhì)的活性越低；酶活力相同時，隨著反應(yīng)時間的增加，抑菌活性也逐漸降低。蛋白酶濃度為50 U/ml時，反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)所對應(yīng)抑菌圈面積為陽性對照抑菌圈面積的90.7%；當(dāng)?shù)鞍酌笣舛仍黾拥?00 U/ml時，反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)所對應(yīng)抑菌圈面積為陽性對照抑菌圈面積的76.7%；當(dāng)胰蛋白酶濃度增加到5 000 U/ml時，反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)所對應(yīng)抑菌圈面積為陽性對照抑菌圈面積的62.4%。

圖8 T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)的透析試驗(yàn)結(jié)果

胃蛋白酶對T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響見圖10。由圖10可知，在50～5 000 U/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著胃蛋白酶酶活力的增加，在相同反應(yīng)時間下，酶活力越高，則抑菌物質(zhì)的活性越低；酶活力相同時，隨著反應(yīng)時間的增加，抑菌活性也逐漸降低。胃蛋白酶濃度為50 U/ml時，反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)所對應(yīng)抑菌圈面積為陽性對照抑菌圈面積的83.4%；當(dāng)胃蛋白酶濃度增加到500 U/ml時，反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)所對應(yīng)抑菌圈面積為陽性對照抑菌圈面積的72.3%。當(dāng)胃蛋白酶濃度增加到5 000 U/ml時，反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)所對應(yīng)抑菌圈面積為陽性對照抑菌圈面積的49.1%。

綜上所述，高濃度的胰蛋白酶或胃蛋白酶均可使T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性降低，說明抑菌物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有可被兩種酶作用的肽鍵。而與中等濃度的兩種蛋白酶反應(yīng)120 min后，抑菌物質(zhì)仍有較高活性，說明抑菌物質(zhì)對胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。

圖10 胃蛋白酶對T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響

2.5.4 pH值對抑菌物質(zhì)活性的影響

pH值對高產(chǎn)菌株T-70-1胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響如圖11所示。在pH值2.0～7.0范圍內(nèi)，隨著pH值的上升，抑菌活性也逐漸增強(qiáng)；在pH值7.0～10.0范圍內(nèi)，隨著pH值的上升，抑菌活性逐漸降低。當(dāng)pH值為7.0時抑菌活性最高，抑菌圈面積為406.6 mm2；在pH值2.0時抑菌活性最低，為陽性對照的38.5%；當(dāng)pH值為10.0時其抑菌圈面積為陽性對照的47.8%。當(dāng)pH值為3.0時其抑菌圈面積為陽性對照的51.5%；當(dāng)pH值為9.0時其抑菌圈面積為陽性對照的53.0%，故T-70-1菌株產(chǎn)胞外抑菌物質(zhì)在pH值3.0～9.0的范圍內(nèi)，有較高的抑菌活性。

圖11 pH值對T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響

2.5.5 加熱處理對抑菌物質(zhì)活性的影響

如圖12所示，當(dāng)加熱溫度為40、60℃時，分別處理30 min和60 min后，抑菌圈面積無明顯變化。當(dāng)加熱溫度為80℃時，處理30 min后，抑菌圈面積降低了11.7%；加熱60 min后，抑菌圈面積降低了13.7%。當(dāng)加熱溫度為100℃時，處理30 min后，抑菌圈面積降低了25.1%；加熱60 min后，抑菌圈面積降低了30.1%；121℃處理后，抑菌物質(zhì)無抑菌活性。綜上可知，菌株T-70-1胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)對100℃以下溫度有較強(qiáng)的耐受性。

圖12 溫度對T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

傳統(tǒng)抗生素的大量使用導(dǎo)致的耐藥性問題日益突出，嚴(yán)重威脅人們的健康；開發(fā)促生長、抗腹瀉的新型飼料添加劑已成為研究熱點(diǎn)。孫雪梅等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬教槽料和保育料中添加天蠶素抗菌肽（300 g/t），有明顯提高日增重和減少腹瀉的功效。王曦堯[16]研究表明，日糧中添加抗菌肽（350 mg/kg）可明顯促進(jìn)吉戎兔生長，降低料重比。呂尊周等[17]用抗菌肽粗提物飼喂肉雞發(fā)現(xiàn)抗菌肽可以抑制腸道中大腸桿菌，促進(jìn)乳酸桿菌等，提高飼料轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而提高蛋雞生產(chǎn)性能，改善蛋雞產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)。本研究所使用的誘變原始菌株Tu-569可改善斷奶仔兔的生產(chǎn)性能，降低幼兔腹瀉率和死亡率[8]，其作為野生型菌株，抑菌活性尚有提高的空間。

選育高產(chǎn)菌株可有效降低發(fā)酵成本。使用單一誘變育種方法，存在突變無法定向、突變率低、遺傳不穩(wěn)定等缺點(diǎn)[18]。采用復(fù)合誘變的方法，能更好地改善菌株的性能。何淼等[19]以鏈霉菌SN03菌株為出發(fā)菌株，利用紫外線誘變結(jié)合微波誘變的處理方法，獲得了高效菌株UV-1-W3，其發(fā)酵液對蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到33.2 mm，抗菌活性比出發(fā)菌株提高了30.2%。李海娜[20]以乳酸鏈球菌ATCC11454為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線、微波、亞硝酸鈉并用的方法最終選育出一株遺傳特性穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，該菌株效價達(dá)到6 200 IU/ml，較原始菌株提高了5倍；通過10 L發(fā)酵罐中試生產(chǎn)Nisin效價達(dá)到9 600 IU/ml左右，大大降低了發(fā)酵成本。本研究通過對Tu-569菌株進(jìn)行紫外-微波誘變，得到了1株性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株T-70-1，其抑菌活性是原菌株的2.74倍。

T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)可被70%飽和度的硫酸銨鹽析；該抑菌物質(zhì)的相對分子質(zhì)量在3.5～8.0 kDa之間；抑菌物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有可被胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的肽鍵；故T-70-1菌株胞外產(chǎn)抑菌物質(zhì)為抗菌肽。Tu-569菌株胞外產(chǎn)抗菌物亦為抗菌肽[7]。兩菌株的抗菌肽對應(yīng)相對分子質(zhì)量均在3.5～8.0 kDa之間。

Tu-569菌株[7]胞外產(chǎn)抗菌肽在pH值9.0時抑菌活性最高，在pH值5.0～10.0的范圍內(nèi)，有較高的抑菌活性；而T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽在pH值7.0時抑菌活性最高，在pH值3.0～9.0的范圍內(nèi)，有較高的抑菌活性。畜禽動物胃液pH值在1.5～2.0之間，腸液pH值一般為8.0～9.0，故胃腸液pH值環(huán)境中T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽能保持較高活性。畜禽動物胃液中胃蛋白酶濃度約為500 U/ml；胰蛋白酶濃度約為250 U/ml[21]。Tu-569菌株[7]胞外產(chǎn)抗菌肽用500 U/ml的胃蛋白酶處理120 min后，抑菌活性為原來的18.8%；用250 U/ml的胰蛋白酶處理120 min后，抑菌活性為原來的33.3%。T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽經(jīng)濃度為500 U/ml胰蛋白酶處理120 min后，抑菌活性是原來的76.7%；抗菌肽經(jīng)濃度為500 U/ml胃蛋白酶處理120 min后，抑菌活性為原來的72.3%。因此，與胃腸液中存在的蛋白消化酶發(fā)生作用后，T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽也保留著大部分的抑菌活性。T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽很適宜在畜禽胃腸道環(huán)境中發(fā)揮抑菌作用。Tu-569菌株[7]胞外產(chǎn)抗菌肽經(jīng)100℃處理30 min后，抑菌活性完全喪失，而T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽經(jīng)100℃加熱60 min后，抑菌圈面積僅降低了30.1%，耐熱性提高，有利于將其制備成粉劑。

綜上所述，T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽耐受畜禽動物胃腸液pH值環(huán)境，適宜在畜禽胃腸道環(huán)境中發(fā)揮抑菌作用，還可耐受高溫處理，為將其制備成新型飼料添加劑并應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖奠定了基礎(chǔ)，有著良好的應(yīng)用前景。

3.2 結(jié)論

經(jīng)紫外-微波誘變獲得了1株高產(chǎn)抗菌肽、遺傳穩(wěn)定的T-70-1菌株，與原菌株Tu-569同屬于Bacillus velezensis種屬。T-70-1菌株除不產(chǎn)接觸酶、可耐受10%和15%的NaCl、可利用D-半乳糖和D-塔格糖外，其余生理生化特性與Tu-569菌株均相同。與原菌株Tu-569相比，T-70-1菌株胞外產(chǎn)抗菌肽抑菌活性更強(qiáng)，是原菌株的2.74倍，性質(zhì)更為穩(wěn)定，具體表現(xiàn)在更耐受胃腸道環(huán)境，更為耐熱，可將其制備成粉劑應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)。