蘋(píng)果全基因組PAL基因家族成員的鑒定及表達(dá)分析

張麗之，樊 勝，安 娜，左希亞，高 彩，張 東，韓明玉

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是苯丙烷類(lèi)代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，由一個(gè)多基因家族編碼，廣泛存在于各種植物和微生物中。它可以調(diào)控莖的伸長(zhǎng)、種子的發(fā)育和果實(shí)的生長(zhǎng)，還可以參與抗逆過(guò)程[1]。研究植物基因組中PAL基因家族成員的染色體定位和分布、基因與蛋白結(jié)構(gòu)及表達(dá)特性對(duì)進(jìn)一步研究其在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能具有重要意義。

1961年，PAL蛋白首次從綠色植物大麥(HordeumvulgareL.)中被分離鑒定[2]，此后相繼在擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、煙草(NicotianatabacumL.)、水稻(OryzasativaL.)、楊樹(shù)(PopulusL.)、番茄(LycopersiconesculentumMill.)、馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)、葡萄(VitisviniferaL.)和刺果松(Pinuslongaeva)等植物中被鑒定，但是不同植物中PAL基因家族成員的數(shù)量差異較大，馬鈴薯中基因拷貝數(shù)較多，擬南芥、煙草、水稻、楊樹(shù)和番茄中基因拷貝數(shù)較少[3-8]。PAL蛋白普遍存在一個(gè)由丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸(Ala-Ser-Gly)組成的活性位點(diǎn)(MIO)，該位點(diǎn)是它們發(fā)揮功能的主要區(qū)域[8-10]。目前已經(jīng)完成了PAL基因在葡萄中的鑒定與分析，發(fā)現(xiàn)葡萄PAL基因可以聚為3類(lèi)，其中VviPAL3、VviPAL4、VviPAL5、VviPAL6單獨(dú)聚為一類(lèi)，可能是因?yàn)樗鼈儊?lái)源于被子植物分化前更為古老的祖先[8]。PAL基因家族在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著多種重要的生物學(xué)作用，可以調(diào)控莖、種子等的生長(zhǎng)，AtPAL1、AtPAL2、AtPAL4在莖中表達(dá)量較高，AtPAL2和AtPAL4均能在種子中表達(dá)[1]。在甘蔗中研究發(fā)現(xiàn)，苯丙氨酸解氨酶PAL參與甘蔗細(xì)胞的防御反應(yīng)，且在抗病品種中活性更高[11-12]。用短波紫外照射被灰霉病菌侵染的粉紅女士蘋(píng)果之后病斑的擴(kuò)大被抑制，同時(shí)PAL活性明顯提高，可見(jiàn)，PAL在蘋(píng)果果實(shí)的抗逆過(guò)程中有著重要作用[13]。除此之外，PAL的轉(zhuǎn)錄活性與果實(shí)發(fā)育有密切聯(lián)系。葡萄中16個(gè)VviPAL基因在果實(shí)發(fā)育早期的表達(dá)均呈先升高后降低的趨勢(shì)，在果實(shí)發(fā)育最后階段表達(dá)模式多樣[8]。研究報(bào)道PAL的活性在蘋(píng)果的果實(shí)發(fā)育過(guò)程中有兩個(gè)高峰，一個(gè)為幼果期，一個(gè)為果實(shí)成熟期，蘋(píng)果未成熟果實(shí)中PAL活性最高，發(fā)育過(guò)程中降至低水平，成熟期間又升高[14-16]，草莓和梨中也有類(lèi)似現(xiàn)象[14，17]。PAL基因家族參與形成植物果實(shí)內(nèi)HCA類(lèi)酚類(lèi)、類(lèi)黃酮、木質(zhì)素等多種重要的次生代謝產(chǎn)物，它們影響果實(shí)的成熟、感官品質(zhì)和顏色等[8，18-22]。Lister等[23]對(duì)9個(gè)蘋(píng)果品種進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)果實(shí)發(fā)育期間PAL的平均活性與最終的類(lèi)黃酮總含量之間有顯著的相關(guān)關(guān)系(r=0.75，P<0.05)。

蘋(píng)果是世界四大水果(蘋(píng)果、葡萄、香蕉、柑橘)之一，是主要的經(jīng)濟(jì)作物，目前關(guān)于蘋(píng)果PAL基因家族的鑒定、特征和功能的系統(tǒng)性分析未見(jiàn)報(bào)道，已發(fā)表的蘋(píng)果全基因組序列為我們鑒定蘋(píng)果中PAL基因提供了線索[24]。利用已有的金冠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和一系列生物信息學(xué)手段，同時(shí)結(jié)合啟動(dòng)子分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等探究蘋(píng)果PAL基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)等，以期明確其在蘋(píng)果生長(zhǎng)發(fā)育，包括不同組織和果實(shí)發(fā)育不同階段中可能發(fā)揮的功能，為深入研究蘋(píng)果苯丙氨酸解氨酶的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和樣品采集

擬南芥中4個(gè)AtPAL的基因序列和蛋白序列根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的基因登錄號(hào)在TAIR網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org)獲得[1]。初步比對(duì)之后獲得的蘋(píng)果中候選PAL基因登錄號(hào)在GDR蘋(píng)果全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)blastp工具中(https://www.rosaceae.org/tools/ncbi_blast)獲得，其相應(yīng)蛋白序列、基因序列、基因定位及基因注釋信息在金冠參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。用于構(gòu)建多物種系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的擬南芥、葡萄、玉米、水稻等多個(gè)單子葉和雙子葉植物的PAL蛋白序列根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的基因登錄號(hào)在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載[8]。金冠以及不同蘋(píng)果雜交種中不同器官的PAL基因表達(dá)數(shù)據(jù)(GSE42873)從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE42873)下載。

試驗(yàn)于2017年在陜西省楊凌示范區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)創(chuàng)新園國(guó)家蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系試驗(yàn)示范果園(108°04′E，34°16′N(xiāo))進(jìn)行。供試材料為五年生長(zhǎng)富2號(hào)/T337/八棱海棠。盛花期采集短枝頂花，盛花期后30 d另外采集幼果(直徑2 cm左右)、短枝頂芽毗鄰葉及短枝莖(直徑2～3 mm)[25]，用于研究組織特異性。為了探究蘋(píng)果PAL基因在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮的功能，試驗(yàn)從盛花期后30 d開(kāi)始，每隔30 d采集一次長(zhǎng)富2號(hào)果實(shí)，共采集5次(盛花期后30、60、90、120、150 d)[26]。所有采集材料(莖，花，葉，盛花期后30 d的幼果包括果肉和果皮，不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)包括果肉和果皮)均用液氮冷凍，-80 ℃保存，用于RNA提取。

1.2 PAL基因家族成員的鑒定

將下載的擬南芥中4個(gè)AtPAL基因的蛋白序列作為查詢序列，在GDR蘋(píng)果全基因組利用blastp工具進(jìn)行比對(duì)(https://www.rosaceae.org/tools/ncbi_blast)，在該數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得估計(jì)值小于e-5的蘋(píng)果基因登錄號(hào)[27-28]，去除重復(fù)基因后，根據(jù)在金冠參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載獲得的相應(yīng)蛋白序列，利用NCBI blastp工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)去掉沒(méi)有PLN02457結(jié)構(gòu)域(description: phenylalanine ammonia-lyase)的基因，獲得蘋(píng)果中的PAL。依據(jù)染色體位置排列對(duì)所獲得的蘋(píng)果PAL基因進(jìn)行命名。利用在線網(wǎng)站ExPaSy(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)MdPAL蛋白的理化性質(zhì)[29]。

1.3 MdPAL染色體定位、序列比對(duì)

基于從金冠蘋(píng)果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載獲得的基因定位和基因注釋信息，利用MapDraw軟件對(duì)MdPAL基因在染色體上的位置進(jìn)行描繪[30]。利用軟件DNAMAN對(duì)MdPAL蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，依據(jù)比對(duì)結(jié)果鑒定MdPAL基因的旁系同源對(duì)[25，31-32]。旁系同源對(duì)基因必須滿足以下2個(gè)條件：(1)兩基因序列對(duì)齊之后，短基因序列與長(zhǎng)基因序列的覆蓋率大于70%；(2)兩基因蛋白序列的一致性大于70%[33-34]。

1.4 MdPAL蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線網(wǎng)站SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)MdPAL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[35]。利用在線網(wǎng)站PHYRE serve v2.0(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2htmlpage.cgi？id=index)預(yù)測(cè)MdPAL蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[36]。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析、基因結(jié)構(gòu)、保守蛋白分析和啟動(dòng)子順式作用元件分析

用MEGA6.0軟件對(duì)蘋(píng)果8個(gè)MdPAL成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，方法采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)，采取以下參數(shù)設(shè)置：校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap重復(fù)1 000次，模式為 p-diastance model，缺口設(shè)置為partial deletion[37]。利用MEGE6.0構(gòu)建蘋(píng)果、擬南芥、葡萄、玉米、水稻等多個(gè)單子葉和雙子葉物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)探究多物種PAL蛋白的進(jìn)化關(guān)系，不同物種的蛋白序列通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道的基因登錄號(hào)在NCBI查詢獲得[8]，參數(shù)設(shè)置同上。利用The Gene Structure Display Serve 2.0(GSDS)(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線網(wǎng)站獲得MdPAL基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)[38]。MdPAL的保守蛋白分析由在線網(wǎng)站MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)完成，除保守蛋白最大數(shù)量設(shè)置為10之外，其余參數(shù)采取默認(rèn)參數(shù)[39]。利用金冠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得MdPAL起始密碼子上游1 500 bp作為啟動(dòng)子序列，利用在線網(wǎng)站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcarehtml)分析其啟動(dòng)子的順式作用元件[25，31-32，40]。

1.6 基因表達(dá)分析

采用改良CTAB法[41]提取RNA，取完整性良好的總RNA經(jīng)RNase-Free DNase處理以去除基因組DNA，使用Clontech SMARTTM Libray試劑盒，按公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作合成cDNA。

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)MdPAL基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。利用Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)MdPAL特異性實(shí)時(shí)熒光定量引物(表1)，并引用文獻(xiàn)中的蘋(píng)果EF-1α(GenBank 登錄號(hào)DQ341381)作為內(nèi)參基因，其特異性引物為：EF-1α-F，5′-ATTCAAGTATGCCTGGGTGC-3′；EF-1α-R，5′-CAGTCAGCCTGTGATGTTCC-3′[42]。MdPAL3、MdPAL4、MdPAL6、MdPAL7四個(gè)基因的編碼序列極其相似，不能設(shè)計(jì)特異性定量引物將它們分離開(kāi)來(lái)，因此共用一對(duì)定量引物[25，31-32]。

按照TaKaRa SYBR? Prime EXTaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為10 μL∶5 μL SYBR? Prime EXTaqTMⅡ 2×，0.5 μL PCR正向引物(10 μmol·L-1)，0.5 μL PCR 反向引物(10 μmol·L-1)，1 μL DNA模板(<100 ng)，加去離子水補(bǔ)足10 μL。qRT-PCR反應(yīng)在Bio-RAD IQ5熒光定量 PCR儀上完成。qRT-PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s；60 ℃退火20 s；72 ℃延伸20 s；40次循環(huán)。用2-ΔΔCt的方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[43]。每個(gè)樣本做3個(gè)平行樣，內(nèi)參和目的基因均做3次生物學(xué)重復(fù)。

利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)GEO對(duì)MdPAL基因的組織特異性進(jìn)行分析。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE42873)下載金冠以及不同蘋(píng)果雜交種不同器官的基因表達(dá)數(shù)據(jù)(GSE42873)，并從中提取MdPAL相關(guān)基因的表達(dá)量[44]。

1.7 數(shù)據(jù)處理及圖表制作

試驗(yàn)按完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用Excel 2010及SPSS 18.0分析軟件進(jìn)行，使用Excel 2010進(jìn)行相關(guān)圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果全基因組PAL基因家族成員的鑒定

利用生物信息學(xué)方法從蘋(píng)果全基因組中鑒定得到8個(gè)PAL基因家族成員(圖1)，依照它們?cè)谌旧w上的位置信息，將它們依次命名為MdPAL1-MdPAL8。

利用EXPASY對(duì)MdPAL的基本信息和理化性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，包括序列長(zhǎng)度、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、平均親水性系數(shù)和脂肪指數(shù)，結(jié)果如表2和表3所示。8個(gè)MdPAL的蛋白長(zhǎng)度在433～753個(gè)氨基酸(amino acid，aa)，其中，MdPAL2最短(433 aa)，MdPAL6最長(zhǎng)(753 aa)。編碼區(qū)序列長(zhǎng)度較長(zhǎng)，均為1 500 bp以上。MdPAL編碼的分子量在47.713～81.748 ku，等電點(diǎn)在5.44～6.39，均略小于7，偏酸性，是酸性蛋白。所有MdPAL的不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，都較穩(wěn)定。除去MdPAL2和MdPAL8，大多MdPAL蛋白均有很好的親水性，平均親水性系數(shù)均小于0。8個(gè)MdPAL蛋白中含量最豐富的氨基酸為亮氨酸和丙氨酸。

2.2 MdPAL染色體定位

根據(jù)鑒定得到的8個(gè)MdPAL的基因定位信息，利用MapDraw工具進(jìn)行染色體定位作圖。由圖1可見(jiàn)，這8個(gè)基因分別定位在1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、8號(hào)、12號(hào)和17號(hào)染色體上，其中，1號(hào)、3號(hào)、8號(hào)和17號(hào)染色體上均僅存在1個(gè)MdPAL基因，4號(hào)和12號(hào)染色體上均存在2個(gè)MdPAL基因。除此之外，本試驗(yàn)鑒定得到1對(duì)MdPAL旁系同源對(duì)(MdPAL3-MdPAL4)。

2.3 MdPAL蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用DNAMAN進(jìn)行MdPAL多重蛋白序列比對(duì)，結(jié)果如圖2所示，所有MdPAL均包含圖中方框圈出的PAL蛋白家族普遍存在的由丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸(Ala-Ser-Gly)組成的MIO保守結(jié)構(gòu)域。

表1 MdPAL定量引物序列

表2 蘋(píng)果中PAL基因的基本信息

表3 MdPAL理化性質(zhì)

圖1 候選MdPAL基因染色體定位Fig.1 Chromosomal locations of MdPAL genes

圖2 候選MdPAL蛋白多重序列比對(duì)Fig.2 Conserved domain alignment of MdPAL proteins

利用在線網(wǎng)站SOPMA和PHYRE serve v2.0進(jìn)行MdPAL二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，結(jié)果如表4和圖3所示，發(fā)現(xiàn)MdPAL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲組成，其中，α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲的占比較高，且所有MdPAL中均是α-螺旋的占比大于無(wú)規(guī)卷曲。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析、基因結(jié)構(gòu)及保守蛋白分析

為了探討不同物種PAL的進(jìn)化關(guān)系，試驗(yàn)收集了一個(gè)包括54條來(lái)自不同物種(其中8條來(lái)自蘋(píng)果，17條來(lái)自葡萄，7條來(lái)自玉米，9條來(lái)自水稻，4條來(lái)自擬南芥，4條來(lái)自煙草，5條來(lái)自白毛楊)的PAL蛋白序列的數(shù)據(jù)集，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果MdPAL與葡萄、擬南芥、楊樹(shù)、煙草的PAL親緣關(guān)系比較近，與水稻、玉米親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，可能是因?yàn)榕c單子葉植物相比，蘋(píng)果、葡萄等雙子葉植物分化時(shí)間更近。此外，對(duì)8個(gè)蘋(píng)果MdPAL蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果(圖5)表明，MdPAL3、MdPAL4、MdPAL6、MdPAL7進(jìn)化關(guān)系比較近，聚為第一群(G1)；MdPAL1和MdPAL5聚為第二群(G2)；MdPAL2和MdPAL8聚為第三群(G3)。

利用GSDS在線網(wǎng)站進(jìn)行MdPAL基因結(jié)構(gòu)分析，圖5-a顯示進(jìn)化關(guān)系較近的MdPAL具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，但也存在一些差異。G1擁有2個(gè)或3個(gè)外顯子，且它們第一個(gè)內(nèi)含子的位置較為保守。G3均有3個(gè)外顯子，G2中的兩個(gè)成員MdPAL1和MdPAL5分別有2個(gè)和3個(gè)外顯子。

利用MEME在線網(wǎng)站對(duì)蘋(píng)果8個(gè)MdPAL成員進(jìn)行基序分析，將10個(gè)基序命名為motif1～motif10。圖5-b顯示G1中的成員都擁有motif1、motif2、motif3、motif4、motif6、motif7、motif8和motif9，motif5和motif10在MdPAL4中缺失；G2中的成員幾乎擁有全部10個(gè)motif，只motif8在MdPAL5中缺失；G3中的成員都擁有motif1、motif2、motif3、motif4和motif5。

表4 候選MdPAL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖3 MdPAL三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig.3 Tertiary structures of MdPAL proteins

蛋白序列由文獻(xiàn)報(bào)道的基因登錄號(hào)在NCBI查詢獲得[8]。The protein sequence was obtained from the NCBI query by the gene landing number reported in the literature[8].圖4 多個(gè)物種中PAL蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic analysis of PAL proteins of different varieties

a，MdPAL無(wú)根進(jìn)化樹(shù)及外顯子-內(nèi)含子分析；b，保守蛋白分析，其中1，motif1；2，motif2；3，motif3；4，motif4；5，motif5；6，motif6；7，motif7；8，motif8；9，motif9；10，motif10；c，motif序列。a，An un-rooted phylogenetic tree of MdPAL proteins and exon-intron analysis; b，Conserved motifs analysis，In picture b: 1，motif1; 2，motif2; 3，motif3; 4，motif4; 5，motif5; 6，motif6; 7，motif7; 8，motif8; 9，motif9; 10，motif10; c，Conserved motifs sequence.圖5 MdPAL基因結(jié)構(gòu)與保守蛋白Fig.5 Gene structure and conserve motifs analysis of MdPAL

2.5 啟動(dòng)子順式作用元件

為了探究PAL在蘋(píng)果中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，利用在線網(wǎng)站PLANTCARE分析了其啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果中8個(gè)MdPAL都擁有響應(yīng)逆境脅迫的順式作用元件；植物激素茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(methyl jasmonate，MEJA)、水楊酸響應(yīng)元件(salicylic)、赤霉素響應(yīng)元件(gibberellin)、植物生長(zhǎng)素響應(yīng)元件(auxin)、乙烯響應(yīng)元件(ethylene)等在8個(gè)候選MdPAL中也有發(fā)現(xiàn)；光周期(circadian)作用元件除MdPAL3和MdPAL4外，在其他成員中均有發(fā)現(xiàn)。

1，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)；2，水楊酸誘導(dǎo)；3，赤霉素誘導(dǎo)；4，生長(zhǎng)素誘導(dǎo)；5，乙烯響應(yīng)；6，脅迫誘導(dǎo)；7，晝夜節(jié)律調(diào)控。1，MeJA-responsiveness; 2，Salicylic acid responsiveness; 3，Gibberellin-responsiveness; 4，Auxin-responsiveness; 5，Ethylene-responsiveness; 6，Stress responsiveness; 7，Circadian control.圖6 啟動(dòng)子順式作用元件Fig.6 Predicted cis-elements in promoter of MdPAL genes

2.6 MdPAL在不同組織中的表達(dá)分析

試驗(yàn)采用在線網(wǎng)站GEO分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩種方法探討MdPAL在不同組織器官中的表達(dá)模式。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE42873)中下載金冠以及不同蘋(píng)果雜交種不同器官的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，提取MdPAL基因表達(dá)量。利用Heatmap軟件制作熱圖(圖7)可以發(fā)現(xiàn)，MdPAL1、MdPAL5、MdPAL2、MdPAL8除在金冠和一些蘋(píng)果雜交種的種子、幼苗、根莖中表達(dá)量較低以外，在別的品種器官中表達(dá)均較高；MdPAL3、MdPAL4、MdPAL6、MdPAL7在M14和M49的葉片中表達(dá)量很高；所有的成員在金冠及不同蘋(píng)果雜交種的種子中幾乎沒(méi)有表達(dá)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究MdPAL基因的功能提供了借鑒。

為了進(jìn)一步探明MdPAL基因在蘋(píng)果生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中可能發(fā)揮的作用，采集蘋(píng)果主栽品種長(zhǎng)富2號(hào)/T337/八棱海棠的不同組織器官(莖、花、果、葉)，研究它們?cè)诓煌M織器官中的表達(dá)模式。由于MdPAL基因結(jié)構(gòu)高度保守，因此8個(gè)基因共設(shè)計(jì)出5對(duì)引物，如表1所示[32-34]。利用SYBR Green試劑盒進(jìn)行蘋(píng)果中MdPAL的組織特異性分析，結(jié)果如圖8所示，發(fā)現(xiàn)進(jìn)化關(guān)系更近的MdPAL1和MdPAL5在4個(gè)組織中均有表達(dá)，但在花和葉的表達(dá)量顯著高于莖和果中的表達(dá)量；進(jìn)化樹(shù)中聚為一類(lèi)的MdPAL2和MdPAL8在4個(gè)不同組織中的表達(dá)情況基本一致，均在葉中的轉(zhuǎn)錄水平更高，在其他3個(gè)組織器官中僅微量表達(dá)；MdPAL3、MdPAL4、MdPAL6、MdPAL7在葉中的表達(dá)量顯著高于其余3個(gè)組織器官，在莖和果中的表達(dá)量也較高。

2.7 MdPAL在不同果實(shí)發(fā)育期的表達(dá)

試驗(yàn)進(jìn)行了MdPAL在果實(shí)發(fā)育5個(gè)時(shí)期的表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MdPAL1在果實(shí)發(fā)育5個(gè)時(shí)期中都沒(méi)有表達(dá)量，其余MdPAL在果實(shí)發(fā)育的5個(gè)時(shí)期均有表達(dá)(圖9)，說(shuō)明MdPAL在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。隨著果實(shí)發(fā)育，MdPAL2、MdPAL5、MdPAL8的轉(zhuǎn)錄水平先降低后升高，MdPAL2在盛花期后30和150 d轉(zhuǎn)錄活性較高，MdPAL5在盛花期后120和150 d表達(dá)量較高，MdPAL8在盛花期后120和150 d表達(dá)量較高，且顯著高于其余3個(gè)時(shí)期。MdPAL3/4/6/7的轉(zhuǎn)錄水平隨著果實(shí)發(fā)育逐漸降低，在盛花期后30 d的表達(dá)量顯著高于其余4個(gè)時(shí)期，可推測(cè)其活性高峰出現(xiàn)在幼果發(fā)育期?？傊琈dPAL的活性高峰出現(xiàn)在果實(shí)發(fā)育前期(盛花期后30 d)或果實(shí)成熟期(盛花期后120、150 d)，可能在果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

3 討論

PAL是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本試驗(yàn)對(duì)蘋(píng)果中的PAL基因進(jìn)行鑒定，并且進(jìn)一步探討了MdPAL蛋白的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及其在不同組織器官和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式。

GD，金冠; M69、M74、M20、X8877、M14、M49、X4102、X4442x2596和X3069x992為不同蘋(píng)果雜交種。GD，Golden Delicious; M6，M74，M20，X8877，M14，M49，X4102，X4442 and X3069 were various apple hybrids.圖7 MdPAL在不同蘋(píng)果品種的不同組織中的表達(dá)模式Fig.7 Expression profiles of MdPAL genes in different tissues and different apple varieties

不同處理間沒(méi)有相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Bars marked without the same lowercase letters showed significant difference at P<0.05.The same as below.圖8 MdPAL在長(zhǎng)富2號(hào)不同組織器官中的表達(dá)模式Fig.8 Expression patterns of MdPAL genes in different tissues in Nagafu No.2

圖9 MdPAL基因在長(zhǎng)富2號(hào)不同時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)模式Fig.9 Expression patterns of MdPAL genes in different periods of fruit of Nagafu No.2

本文在蘋(píng)果中共鑒定出8個(gè)MdPAL基因，比白毛楊、水稻、擬南芥中多，這可能與蘋(píng)果基因組較大和全基因組復(fù)制有關(guān)[24]。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MdPAL結(jié)構(gòu)高度保守，MdPAL成員都含有一個(gè)由Ala-Ser-Gly組成的高度保守的亞甲基咪唑酮(MIO)親電基團(tuán)[8]。本試驗(yàn)對(duì)MdPAL蛋白特性進(jìn)行了分析，包括序列長(zhǎng)度、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、平均親水性系數(shù)和脂肪指數(shù)，發(fā)現(xiàn)8個(gè)MdPAL蛋白均具有較好的親水性和穩(wěn)定性，并且均略顯酸性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，大多數(shù)MdPAL與煙草、白毛楊等雙子葉植物的PAL蛋白親緣關(guān)系更近，可能來(lái)源于同一祖先。大多植物中，PAL基因可以分為2～3個(gè)不同的類(lèi)群或亞群[10]，蘋(píng)果中8個(gè)MdPAL蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)也聚為3類(lèi)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)聚為同一類(lèi)的MdPAL基因結(jié)構(gòu)較為保守，外顯子和內(nèi)含子的數(shù)量基本一致，motif也基本一致。另外蘋(píng)果中所有MdPAL成員都擁有響應(yīng)逆境脅迫的順式作用元件，這一點(diǎn)與前人研究的PAL基因家族參與抗逆過(guò)程一致[1，11-13]

本文通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩種方法分析了蘋(píng)果PAL基因家族成員在不同組織中的表達(dá)模式。通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)我們發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中聚為一類(lèi)的MdPAL表達(dá)模式相似，但也存在細(xì)微差異。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)MdPAL的組織特異性進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)MdPAL3/4/6/7在莖中有較高的表達(dá)水平，可能是因?yàn)榕c它們親緣關(guān)系較近的AtPAL1和AtPAL2具有調(diào)控莖伸長(zhǎng)的功能[1]。MdPAL1和MdPAL5除了在葉中表達(dá)量較高以外，在花中也有較高的表達(dá)量，推測(cè)它們可能在花的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，這與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)得出的結(jié)果一致，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。MdPAL3/4/6/7在葉中的表達(dá)量最高，推測(cè)它們發(fā)揮功能的部位可能主要在葉，這一點(diǎn)也與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)得出的結(jié)果一致。G3中的MdPAL2和MdPAL8的組織特異性相似，在葉中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他3個(gè)組織部位，可推測(cè)二者發(fā)揮功能的主要部位可能是葉。

為了進(jìn)一步探究MdPAL在果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期可能發(fā)揮的功能，本文在果實(shí)發(fā)育的5個(gè)時(shí)期對(duì)MdPAL的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。MdPAL1在果實(shí)發(fā)育的5個(gè)時(shí)期都沒(méi)有表達(dá)量，推測(cè)其在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不發(fā)揮功能，但有待進(jìn)一步驗(yàn)證。隨著果實(shí)發(fā)育，MdPAL2、MdPAL5、MdPAL8轉(zhuǎn)錄活性均是先降低后升高，與前人研究一致[14-16]。除了MdPAL1以外，其余MdPAL在不同時(shí)期的果實(shí)中均有較高的表達(dá)水平，其中，MdPAL2的活性高峰出現(xiàn)在果實(shí)發(fā)育前期和果實(shí)成熟期，MdPAL5和MdPAL8的轉(zhuǎn)錄水平高峰出現(xiàn)在果實(shí)成熟期，MdPAL3/4/6/7的活性高峰出現(xiàn)在幼果發(fā)育期，說(shuō)明MdPAL可能在果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，這與前人研究相符[14-16]。PAL參與形成植物體內(nèi)類(lèi)黃酮等次生代謝物質(zhì)，并且其活性與類(lèi)黃酮含量顯著相關(guān)[10，18，20，23]，由此推測(cè)蘋(píng)果中PAL基因家族成員可能是通過(guò)影響果實(shí)中類(lèi)黃酮等物質(zhì)的含量來(lái)調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育和成熟過(guò)程的。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究MdPAL基因在調(diào)控蘋(píng)果生長(zhǎng)發(fā)育，包括不同組織器官和果實(shí)發(fā)育不同階段中可能發(fā)揮的功能奠定了基礎(chǔ)。