用于軟骨缺損修復(fù)的殼聚糖水凝膠降解性能的表征*

朱飛燕朱天飛梁仟譚回熊建義**

（1.中山大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510275；2.深圳市第二人民醫(yī)院組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518035；3.深圳市第二人民醫(yī)院深圳神經(jīng)外科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，廣東深圳518035）

目前，創(chuàng)傷和關(guān)節(jié)炎等引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損及骨組織損傷患者日益增多，特別是關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損占很大比例[1]。軟骨是一種高度分化的結(jié)締組織，由于其無血管和淋巴管，其營(yíng)養(yǎng)液主要來自滑液和軟骨下血管，尤以前者為主要來源，且軟骨細(xì)胞埋于稠厚的細(xì)胞外環(huán)境中，缺乏遷徙能力，自愈能力有限，因此其缺損修復(fù)能力非常有限，軟骨缺損修復(fù)仍然是一個(gè)醫(yī)學(xué)難題[2]。

近年來，軟骨組織工程的興起和發(fā)展為治療軟骨缺損疾病帶來了新的希望[3,4]。軟骨組織工程的一大重要因素即支架材料，支架材料必須能夠很好的模擬細(xì)胞外環(huán)境，并且是生物可降解或可吸收的材料。尋找合適的細(xì)胞支架材料所面臨的最大挑戰(zhàn)就是人體組織的復(fù)雜性。水凝膠中含有大量的水分，由于其柔軟，可以形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，具有很好的生物相容性，是細(xì)胞外基質(zhì)的理想替代材料，并具有生物粘附性以及生物可降解性[1]。水凝膠的溶脹性、響應(yīng)性、多孔結(jié)構(gòu)利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送以及代謝產(chǎn)物的輸出等優(yōu)良的性質(zhì)使其成為組織工程支架材料的理想選擇[5]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的軟骨修復(fù)的水凝膠主要有瓊脂類[6,7]、海藻酸類[8]、纖維蛋白類[6,9]、聚乙二醇類（poly ethylene glycol,PEG）[10]、透 明質(zhì)酸 類（hyaluronic acid,HA）[11]以及殼聚糖類[12,13]等。目前，殼聚糖水凝膠用于軟骨缺損修復(fù)被廣受關(guān)注，因?yàn)闅ぞ厶蔷哂衅咸烟前芬约癗-乙酰氨基葡萄糖的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與軟骨中的粘多糖成分相似，可以進(jìn)一步促進(jìn)軟骨缺損的修復(fù)[14]。

將水凝膠作為支架材料用于軟骨缺損修復(fù)的研究很多，但很少關(guān)注支架材料的體內(nèi)外降解。本研究采用羥乙基脫乙酰殼多糖（glycol chitosan,GC）與二醛基聚乙二醇（OHC-PEG-CHO）通過席夫堿反應(yīng)交聯(lián)而形成水凝膠。該水凝膠成膠條件溫和，成膠時(shí)間可控，具有良好的生物相容性，并且具有可注射性，是一種理想的軟骨組織工程支架材料。本文以該水凝膠為例研究了水凝膠在體外以及動(dòng)物皮下的降解情況，為水凝膠作為軟骨缺損修復(fù)支架材料的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

GC，PEG（分子量2 kDa，由美國(guó) Sigma公司提供）；磷酸緩沖鹽（PBS）（由美國(guó)Gibco公司提供）；二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide,DCC），4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine,DMAP）（由北京百靈威試劑公司提供）。

1.2 OHC-PEG-CHO 的合成［15，16］

OHC-PEG-CHO的合成過程與文獻(xiàn)報(bào)道的類似：對(duì)甲酰苯甲酸（2.4 g,16 mol），DCC（3.3 g,16 mmol），DMAP（0.366 g,2 mmol）溶于適量的CH2Cl2，混合均勻后轉(zhuǎn)移到250 ml的單口燒瓶中，放置37℃水浴中攪拌，然后加入 PEG（4 g,2 mmol）的 CH2Cl2溶液，共用CH2Cl2200 ml。反應(yīng)24 h后將反應(yīng)物過濾,將濾液濃縮后加入異丙醇，70℃溶解后，-20℃冷卻重結(jié)晶后迅速過濾。將過濾的固體水洗離心（10000 rpm,10 min）4次后凍干，得到產(chǎn)物OHC-PEG-CHO，產(chǎn)率為80%。

1.3 水凝膠的制備

GC與OHC-PEG-CHO均在紫外燈下照射1 h進(jìn)行滅菌。水凝膠（GC/OHC-PEG-CHO：2 wt%/2 wt%）的制備：用PBS配置250 μl GC溶液（4%w/v）與250 μl的OHC-PEG-CHO溶液（4%w/v），混合溶液加入模具中，5 min內(nèi)形成水凝膠。

水凝膠（GC/OHC-PEG-CHO：2 wt%/1 wt%）的制備：將250 μl的GC溶液（4%w/v）與250 μl的OHCPEG-CHO溶液（2%w/v），混合溶液加入模具中，5 min內(nèi)形成水凝膠。

1.4 水凝膠的體外降解實(shí)驗(yàn)

將0.5 ml不同濃度的水凝膠（GC/OHC-PEGCHO：2 wt%/2 wt%和2 wt%/1 wt%）制備完成后，分別裝入25 ml無菌PBS的樣品瓶中，樣品瓶使用高壓蒸汽（121℃,30 min）提前滅菌。將樣品瓶置于搖床（25℃,100 rpm）中進(jìn)行震蕩，定期取出水凝膠，測(cè)定pH值、重量和體積變化。①pH值的測(cè)定：將水凝膠從降解液取出后，用已校準(zhǔn)的pH計(jì)測(cè)定。②重量變化的測(cè)定：將水凝膠從降解液中取出放在濾紙上，用濾紙輕輕擦拭，直至濾紙上無明顯的水痕后稱重。水凝膠的質(zhì)量即某個(gè)時(shí)間點(diǎn)水凝膠的重量占初始重量的百分比。每組水凝膠的質(zhì)量測(cè)定為3個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值。③體積變化的測(cè)定：水凝膠制備的過程使用圓柱形的模具。水凝膠的體積測(cè)定是將水凝膠從降解液中取出放在濾紙上，用濾紙輕輕擦拭，直至濾紙上無明顯的水痕后，用游標(biāo)卡尺測(cè)出水凝膠的高和直徑，從而計(jì)算出水凝膠的體積。水凝膠的體積即某個(gè)時(shí)間點(diǎn)水凝膠的體積占初始體積的百分比。每組水凝膠的體積測(cè)定為3個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值。

1.5 水凝膠的皮下降解實(shí)驗(yàn)

新西蘭兔，雄性、8周齡、體重2.5～3.0 kg（由北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供），在正常條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)取食物和水。動(dòng)物的照料及處理均參照深圳市第二人民醫(yī)院關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和照料指導(dǎo)規(guī)則。新西蘭兔使用戊巴比妥鈉（3%）腹腔注射麻醉后，剃除背部毛后用碘伏消毒，手術(shù)剪剪出長(zhǎng)度為10 mm的傷口。在皮膚下埋入0.5 ml的無菌水凝膠（GC/OHC-PEG-CHO：2 wt%/2 wt%）。傷口用手術(shù)線縫合。定期取出新西蘭兔背部水凝膠，10%的福爾馬林固定，石蠟包埋，切出4 μm的薄片后HE染色觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Origin 9（Origin Lab Lnc,USA）軟件對(duì)所收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，獲得的數(shù)據(jù)通過軟件求平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。

2 結(jié)果

2.1 水凝膠降解過程中pH變化表征

比較不同濃度的水凝膠（GC/OHC-PEG-CHO：2 wt%/2 wt%和2 wt%/1 wt%）在體外降解的降解液的pH值。如圖1所示，兩種濃度的水凝膠在體外降解的過程中pH基本維持中性，不會(huì)產(chǎn)生酸性或堿性的降解產(chǎn)物，這有利于將水凝膠應(yīng)用于軟骨缺損修復(fù)。

圖1 水凝膠體外降解的pH變化圖

2.2 水凝膠降解過程中質(zhì)量和體積變化表征

如圖2和圖3所示，水凝膠（GC/OHC-PEGCHO：2 wt%/1 wt%）在6周時(shí)全部降解，而水凝膠（GC/OHC-PEG-CHO：2 wt%/2 wt%）在8周時(shí)質(zhì)量為初始質(zhì)量的（44.30±5.51）%，8周時(shí)體積為初始體積的（50.64±9.81）%，該降解速度與軟骨修復(fù)速率一致。

圖2 水凝膠體外降解的質(zhì)量變化圖

圖3 水凝膠體外降解的體積變化圖

因此，水凝膠的降解速率與組分的濃度有關(guān)，濃度越大，水凝膠的降解時(shí)間越長(zhǎng)?？赡苁请S著水凝膠組分濃度的增加，水凝膠的交聯(lián)度增加，降解時(shí)間變長(zhǎng)。

2.3 水凝膠降解過程中相容性表征

根據(jù)以上測(cè)試結(jié)果，我們選取水凝膠（GC/OHCPEG-CHO：2 wt%/2 wt%）繼續(xù)進(jìn)行體內(nèi)相容性的測(cè)試。動(dòng)物的皮下植入實(shí)驗(yàn)可考察材料在降解過程中產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)、過敏反應(yīng)等，為材料的進(jìn)一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)。水凝膠植入3周后的體積明顯減小，同時(shí)水凝膠的表面已附上動(dòng)物的組織（圖4）。由此可見，水凝膠在降解的過程中，與動(dòng)物的相容性很好。將體內(nèi)取出的水凝膠進(jìn)行HE染色分析示水凝膠在皮下組織中無明顯的炎癥反應(yīng)（圖5）。

圖4 水凝膠植入前的初始狀態(tài)（A）和皮下植入3周后取出的狀態(tài)（B）

圖5 水凝膠皮下植入3周后取出的HE染色（A、B）

3 討論

本研究考察了GC/OHC-PEG-CHO水凝膠的降解性能，降解實(shí)驗(yàn)表明其降解速率與分組濃度有關(guān)?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)水凝膠成分的濃度來調(diào)控水凝膠的降解時(shí)間。將水凝膠植入動(dòng)物皮下的實(shí)驗(yàn)表明，水凝膠的相容性較好，與動(dòng)物組織無明顯的炎癥反應(yīng)。因此，GC/OHC-PEG-CHO水凝膠可作為一種優(yōu)良的軟骨組織工程支架材料的選擇。后續(xù)，仍需將該水凝膠進(jìn)行軟骨修復(fù)的性能表征研究，以期為臨床的軟骨組織工程提供一種理想的支架材料。

綜上，降解性能的測(cè)試表明水凝膠的降解時(shí)間與水凝膠組分的濃度有關(guān)，水凝膠的組分濃度越大，水凝膠的降解時(shí)間越長(zhǎng)。動(dòng)物的皮下植入測(cè)試表明水凝膠植入后，與組織無明顯的炎癥反應(yīng)，具有良好的生物相容性。因此，GC/OHC-PEG-CHO水凝膠可作為一種軟骨組織工程支架材料的備選。