長壽命BOD微生物傳感器的研制及應用

孫好芬，王 露，高玉璽，劉 宇，趙炳彥

(青島理工大學環(huán)境與市政工程學院，山東青島266033)

在水質(zhì)評價中，生化需氧量是目前衡量水質(zhì)有機污染常用的重要指標。目前廣泛應用的BOD5測定方法是標準稀釋法［1］，操作復雜、耗時耗力，不利于大批量樣品的分析。而對于庫侖滴定法、差壓法、活性污泥法和相關計算法等［2－3］，前兩種方法也不能縮短時間，后兩種方法又有較大的局限性，因此也不能滿足實際要求，且不能及時反映排放水的污染程度，因而無法進行現(xiàn)場監(jiān)控。由此，實際工作中迫切需要一種操作簡單、準確快速、自動化程度高、應用范圍廣的新方法測定BOD，智能型BOD快速測定儀就是在此迫切要求下產(chǎn)生的一種集微生物學與現(xiàn)代電子技術于一體的高新技術產(chǎn)品。國內(nèi)外已有文獻［4－5］報導，日、美、英、德等國家已有商品化的生物傳感器快速測定儀，且日本已制定了有關生物傳感器測定BOD的工業(yè)標準［6］。我國已在2009年《水質(zhì)·生化需氧量BOD的測定(HJ05－2009)》一文中也已明確規(guī)定使用微生物傳感器快速測定法。所以，將快速生物傳感器監(jiān)測技術和方法引入環(huán)境水處理領域，將多學科的最新技術進行交叉組合，開發(fā)新型的水質(zhì)分析和廢水處理過程的監(jiān)測儀器是一個必然的發(fā)展趨勢。

1 實驗材料與微生物傳感器的制備

1.1 菌種

采用具有高效單一菌種(自行分離、培養(yǎng)、提純，未鑒定)。

1.2 試劑

(2)BOD標液:中國環(huán)境監(jiān)測總站－－將葡萄糖和谷氨酸各150mg溶解并定容至100 mL，其BOD值為(2000±370)mg/L。

1.3 儀器

LY－07型BOD智能生物檢測儀;恒溫生化培養(yǎng)箱;恒溫( ±0.1℃)搖床;離心機。

1.4 微生物膜的制備

1.4.1 菌種的培養(yǎng)

取青島某藥廠廢水，充分振蕩、靜置，取少量富含高效菌種的上清液接種于培養(yǎng)基中，在(37±1)℃條件下振蕩培養(yǎng)48h，冷卻，再以4500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，得到濕菌體。用0.9%的NaCl液清洗2次，分離，再接種到100 mL的培養(yǎng)基中，進行培養(yǎng)，得到乳白色濕菌體后置于冰箱中4℃保存，備用。

1.4.2 微生物膜的制備

所選擇的微生物敏感材料是對污水中有機物有較強分解代謝能力的微生物，在保持微生物活性的前提下，取一定量的濕菌體與一定量的聚乙烯醇溶液混合，均勻地涂在0.45μm的濾膜上，并加以固定，構成固定化微生物膜。

1.5 微生物膜的活化

微生物膜保存于0～4℃條件下，使用前用蒸餾水清洗后安裝在電極上，浸泡于緩沖溶液中1～2d，加入適量BOD標準溶液，開機活化1d。

1.6 儀器工作參數(shù)

測量時長為15min;BOD標液:(2000±370)mg/L。

而夏天，聽著外面猛烈的雨聲，心里漸漸感覺到了局促，什么時候才可以走呢？外面有沒有公交車？即使有公交車，這個遙遠而陌生的地方，他能夠順利地回去嗎？曉曉是他心目中的女神，這是他和她單獨相處的第一個晚上，他不能冒犯她，他不能唐突她，如果不走，他可以做到嗎？

2 實驗結果

2.1 微生物的篩選

目前國內(nèi)外研制的BOD傳感器多用單一菌種［7－10］:丁酸梭菌、假單孢菌［7］、異常漢遜氏酵母菌［8］、皮狀絲孢酵母菌［9］、芽孢桿菌［10］等，與我們自行培養(yǎng)的高效菌種相比較，結果表明:經(jīng)特殊水質(zhì)的廢水分離、提取，然后再次培養(yǎng)的微生物(未經(jīng)鑒定)純度和活性較高，壽命長，通用性也較強，可以測定生活污水和某農(nóng)藥、化工廢水的BOD值，并且使用時間長達12個月，具有前述菌種所無法比擬的優(yōu)越性。而采取長期馴化菌種廢水［11］接種獲得的微生物菌種，測定結果重復性不高，精密度差，主要原因可能是由于馴化廢水中菌類的種類和數(shù)量不穩(wěn)定，微生物分布不均勻。

2.2 生物膜的制備

細胞固定化最常用的方法是包埋。利用凝膠包埋、樹脂吸附固定以及交聯(lián)等固定化技術進行比較［12］，確定以吸附包埋固定化技術比較適宜于器材的大批量生產(chǎn)，并且測定線性范圍較廣。將已培養(yǎng)成功的微生物固定在聚乙烯醇凝膠中，再用超濾膜制成片狀微生物薄膜。此薄膜在常溫條件下包埋，機械強度、韌性、透氣性均交好，且易于更換，使用方便、快速。

2.3 微生物膜的使用壽命

由文獻［13－14］數(shù)據(jù)可知，由酵母菌研制的BOD微生物傳感器的線性響應范圍為0～200mg/L，響應時間為15min，穩(wěn)定地工作壽命在3個月以上;大腸桿菌BOD微生物傳感器在0～500mg/L的BOD濃度范圍內(nèi)具有很好的線性關系，工作壽命略長，在4～6個月以上，其線性相關系數(shù)可達到0.99以上，響應時間縮短為12min內(nèi)。而LY－07微生物薄膜線性響應范圍可達2～4000 mg/L，響應時間低于為8min，使用壽命30d以上，甚至可長達12個月，是迄今文獻報道中使用壽命最長的BOD微生物薄膜，推測可能與微生物膜的機械強度和性能較高以及微生物菌種的類型有關。

2.4 儀器工作參數(shù)的校正方式

儀器工作參數(shù)采用單點多次校正。

2.5 儀器的準確度及精密度

2.5.1 準確度

根據(jù)中國環(huán)境監(jiān)測總站提供的標準樣品進行檢驗，結果如表1所示。

表1 準確度檢驗

2.5.2 精確度

根據(jù)中國環(huán)境監(jiān)測總站規(guī)定的標準，采用谷氨酸和葡萄糖各150 mg溶解并定容至100 mL，其BOD值為(2000±370)mg/L，連續(xù)測定8次，結果如表2所示。

表2 精確度檢驗

由準確度及精密度可以發(fā)現(xiàn)，LY－07型BOD智能生物檢測儀測量的準確度與精確度較好。

2.6 儀器的測定周期

LY－07型BOD智能生物檢測儀的測定周期較短，響應時間最多不超過10min，一般為3～5min，洗脫時間為15min左右(并且現(xiàn)在洗脫時間也在大大縮短，5min時亦可獲得較好數(shù)據(jù)，見表3)?？傊?，一般均可在25min內(nèi)完成樣品的測定。

表3 洗脫時間對實驗結果的影響

由此可見，對于某些水樣，減少洗脫時間，對實驗結果影響不大。

2.7 在實際工作中的應用

工業(yè)廢水BOD測定結果的對比見表4。

表4 工業(yè)廢水BOD測定結果的對比

由表4可以看出，儀器法測定廢水中的BOD與稀釋倍數(shù)法有著較好的一致性。

為了檢驗儀器的精密度，我們分別對第二毛紡廠和第四啤酒廠的廢水進行了測定，結果如表5所示。

表5 儀器的精密度檢驗結果

3 討論

本研究制備的LY－07型BOD微生物膜傳感器，采用了優(yōu)良菌種及利于微生物生存和新陳代謝的固定化方法，與報道的同類研究相比較，具有使用壽命長，微生物膜機械強度和性能好，易于多次更換使用，測定周期短(可減少洗脫時間)，且具有較高的準確度和靈敏度等特點。在環(huán)境監(jiān)測的實際應用中，與經(jīng)典的碘量法相比較，具有較好的相關性，結果表明:LY－07型BOD微生物膜傳感器的研發(fā)及其在環(huán)境監(jiān)測中的使用是具有實際意義的，使BOD在線監(jiān)測即將廣泛應用。