B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤組織中YAP1和P53的表達(dá)及意義

沈 艷，何新明，林喜娜，楊 通，陳貴東，古婉儀，顧 霞

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 病理科， 廣東廣州 511447；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，廣東廣州510120

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)是一組來源于淋巴結(jié)或結(jié)外淋巴組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率較高。NHL種類繁多，包括B細(xì)胞和T/NK細(xì)胞淋巴瘤兩大類、數(shù)十種類型，在臨床表現(xiàn)、形態(tài)學(xué)、免疫表型和遺傳學(xué)等方面具有高度異質(zhì)性，目前其治療方法主要是化療，但部分患者療效不佳或不持久。近年來淋巴瘤治療的研究熱點(diǎn)集中在通過分子靶向來干擾關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而抑制腫瘤細(xì)胞的存活和增殖，以提高療效。Hippo通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條在生物進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，具有維持細(xì)胞增殖和凋亡平衡、調(diào)控器官體積等功能[1-4]。YAP1蛋白 (Yes-associated protein 1)是Hippo信號通路的核心效應(yīng)因子，具有轉(zhuǎn)錄共激活因子活性[2]。研究發(fā)現(xiàn)Hippo-YAP1通路與P53蛋白存在交互作用[3]，該通路異?？蓪?dǎo)致人體多種疾病包括腫瘤的發(fā)生。目前，以Hippo-YAP1通路為靶點(diǎn)的治療策略為腫瘤治療提供了新思路[5-6]。雖然Hippo-YAP1通路在腫瘤中的研究已成為熱點(diǎn)，但迄今其在淋巴瘤方面的研究報(bào)道十分少見。本研究檢測了YAP1蛋白在B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B cell non-Hodgkin's lymphoma，B-NHL)中的表達(dá)，并分析其與p53蛋白表達(dá)的相關(guān)性，旨在進(jìn)一步探討B(tài)-NHL發(fā)生的分子機(jī)制，為臨床診斷和治療提供新思路。

材料和方法

1 標(biāo)本來源 收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2012 - 2017年經(jīng)病理檢查確診為的B-NHL的存檔標(biāo)本60例，入選標(biāo)本由兩名資深病理專家復(fù)讀切片，對其組織學(xué)類型進(jìn)行回顧性分析并確診。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016年版WHO關(guān)于淋巴組織腫瘤分類[7]。其中，男38例，女24例，年齡20 ～89歲，中位年齡63歲。另選取25例反應(yīng)性增生淋巴組織(reactive hyperplasia of lymphoidtissue，RHL)標(biāo)本作為對照組。

2 主要試劑 濃縮型鼠抗人單克隆抗體YAP1(克隆號：GT256)購自美國GeneTex公司，工作濃度按1∶800進(jìn)行稀釋。即用型P53鼠抗人單克隆抗體為Dako公司產(chǎn)品，免疫組化GTVisionTMⅠ/HRP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自基因科技有限公司。

3 組織芯片的制作 在石蠟包埋標(biāo)本的HE切片上選擇具有代表性的一個(gè)區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記，用組織芯片儀在相應(yīng)標(biāo)本蠟塊(即供體蠟塊)上標(biāo)記的相應(yīng)部位打孔采集組織芯(直徑2 mm)，然后將組織芯轉(zhuǎn)移至另一個(gè)空白蠟塊(即受體蠟塊)相應(yīng)孔位上，每個(gè)組織芯之間的間距為1.5 mm，制成陣列蠟塊。對陣列蠟塊進(jìn)行4μm厚連續(xù)切片，再將切片轉(zhuǎn)移至載玻片上，即獲得組織芯片。

4 YAP1、P53蛋白檢測 采用免疫組織化學(xué)GTVision染色法：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS液浸泡5 min，加枸櫞酸，微波抗原修復(fù)，中火3 min×3次；自然冷卻至室溫；PBS液沖洗3 min×3次；3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性孵育10 min；PBS液沖洗3 min×3次；滴加一抗，其中YAP1抗體按1∶800進(jìn)行稀釋，室溫箱孵育60 min，PBS沖洗3 min×3次；滴二抗(GTVisionTMⅠ型聚合物)，室溫孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次；DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每批染色均設(shè)陽性對照和陰性對照。以已知陽性反應(yīng)片做陽性對照，以PBS替代一抗做陰性對照。

5 結(jié)果判斷YAP1表達(dá) 定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核，P53表達(dá)定位于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞呈黃色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。YAP1采用半定量方法判斷結(jié)果：1)按細(xì)胞染色強(qiáng)弱評分：0分為不著色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色；2)記取組織芯片中200個(gè)腫瘤細(xì)胞，陽性細(xì)胞所占百分比。計(jì)數(shù)陽性染色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比：0分無陽性細(xì)胞；1分陽性細(xì)胞數(shù)＜10%；2分陽性細(xì)胞數(shù)10% ～ 50%；3分陽性細(xì)胞數(shù)＞50%。按以上兩項(xiàng)乘積判斷結(jié)果：0為陰性，1 ～ 2為(+)，3 ～ 4為(++)，＞4為(+++)。P53按陽性百分比分級：(-)無陽性腫瘤細(xì)胞或陽性腫瘤細(xì)胞＜30%；(+)陽性腫瘤細(xì)胞≥30%。

圖1 YAP1蛋白在各淋巴組織中的表達(dá) A：DLBCL中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，定位于胞質(zhì)(IHC×200)； B：SLL中呈彌漫強(qiáng)陽性表達(dá)(IHC×100)； C：RHL中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞彌漫分布于濾泡區(qū)和濾泡間區(qū)，其中濾泡生發(fā)中心表達(dá)強(qiáng)度最高(IHC×50)； D：RHL中局部(圖左側(cè))可見成熟漿細(xì)胞富集(HE×200)； E：在成熟漿細(xì)胞中呈陰性表達(dá)，其周圍淋巴細(xì)胞呈陽性表達(dá)(IHC×200)； F：在DLBCL間質(zhì)血管內(nèi)皮呈陽性表達(dá)(IHC×50)Fig. 1 YAP1 expression in different lymphoid tissues A: High expression in DLBCL, and the cellular immunolocalization was cytoplasmic,IHC×200; B: Diffused strong positive expression in SLL, IHC×100; C: High expression in RHL, and the positive cells were distributed in the follicular and interfollicular regions, and the expression intensity of follicular germinal center was the highest, IHC×50;D: Mature plasmacytes enriched locally (left part) in RHL, HE×200; E: Negative expression in mature plasma cells and positive expression in peripheral lymphocytes, HE×200; F: Positive expression in the interstitial endothelium of DLBCL, IHC×50

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行處理，組間率的比較采用Fisher確切概率法，一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 B-NHL類型與分組 60例B-NHL包括彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL) 49例，小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(small lymphotic lymphoma，SLL) 7例，套細(xì)胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL) 4例。鑒于DLBCL生物學(xué)行為呈高侵襲性，而SLL和MCL為相對惰性，且病例數(shù)較少，為便于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將后兩者合并為惰性組B-NHL。同時(shí)，按CD10、BCL-6和MUM1的表達(dá)將DLBCL分為生發(fā)中心B細(xì)胞型(germinal center B cell-like，GCB)和非生發(fā)中心B細(xì)胞型(non-germinal center B cell-likenon-GCB)兩個(gè)亞型，其中GCB型10例，non-GCB 39例。

2 YAP1在B-NHL和RHL中的表達(dá) YAP1在B-NHL和RHL中的表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)。其中在DLBCL中的表達(dá)陽性率為61.2%，在惰性組B-NHL和RHL中表達(dá)陽性率均為100%。YAP1在DLBCL表達(dá)的陽性率低于惰性組B-NHL和RHL (P＜0.05)。其中YAP1在GCB型和non-GCB型DLBCL的表達(dá)陽性率分別為60%(6/10)和61.5%(24/39)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在RHL中，YAP1在濾泡生發(fā)中心的染色強(qiáng)度高于濾泡套區(qū)和濾泡間區(qū)，雖然為彌漫表達(dá)模式，但在成熟漿細(xì)胞中未見表達(dá)。此外，YAP1在少數(shù)B-NHL血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)中亦呈中-高強(qiáng)度陽性表達(dá)，而在RHL中血管內(nèi)皮呈陰性或弱陽性表達(dá)。見表1，圖1。

3 P53在B-NHL和RHL中的表達(dá) P53在B-NHL中的總體表達(dá)陽性率為16.7%(10/60)，其中在DLBCL中表達(dá)陽性率為18.4%(9/49)，在惰性組B-NHL中僅1例SLL呈陽性表達(dá)，陽性率為9.1%(1/11)，而在25例RHL中未見表達(dá)，陽性率為0。P53在DLBCL和惰性組B-NHL表達(dá)的陽性率高于RHL (P＜0.05)，但在DLBCL和惰性組B-NHL間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

4 YAP1、P53表達(dá)在B-NHL中的相關(guān)性 YAP1蛋白在P53蛋白陽性組與陰性組的表達(dá)率分別為60%(6/10)和70%(35/50)，兩組間YAP1蛋白表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。在B-NHL中，YAP1蛋白表達(dá)與p53蛋白表達(dá)無顯著相關(guān)性(P＞0.05)。見表2。

表2 YAP1和P53在B-NHL中表達(dá)的相關(guān)性Tab. 2 Correlation between expression of YAP1 and P53 in B-NHL (n, %)

討 論

Hippo通路最早是由Edgar在果蠅(Drosophila)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，對細(xì)胞增殖、分化和凋亡起著重要調(diào)控作用[8-9]。該通路在生物進(jìn)化上高度保守，其在哺乳動物中信號傳遞順序則后來由Dong等[10]通過小鼠模型實(shí)驗(yàn)首次確定。YAP1是Hippo信號通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)因子，具有轉(zhuǎn)錄共激活因子活性。通常情況下，磷酸化失活的YAP1定位在細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)去磷酸化后被活化，然后迅速由細(xì)胞質(zhì)移至細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而激活靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[11-12]。Hippo-YAP1通路在機(jī)體多種生理病理過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，如調(diào)控器官大小、促進(jìn)組織再生、維持干細(xì)胞自我更新等[13-14]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，YAP1在卵巢癌、宮頸癌、肝癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌等多種人類實(shí)體腫瘤中呈高表達(dá)，且與腫瘤的高侵襲性和不良預(yù)后有關(guān)[15-19]，提示YAP1在這些腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著癌基因和抗凋亡作用。然而，最近對結(jié)直腸癌和乳腺癌等實(shí)體腫瘤的部分研究則得到相反的結(jié)論，認(rèn)為YAP1可能作為一種抑癌基因參與了這些腫瘤的發(fā)生[20-21]。雖然，活化的YAP1通常情況下富集在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，但新近研究表明，胞質(zhì)定位的YAP1可通過促進(jìn)β-catenin降解、抑制Wnt信號通路等方式起到腫瘤抑制因子作用[22]。綜上，目前學(xué)者們認(rèn)為YAP1在人類惡性腫瘤中扮演著原癌基因或抑癌基因的雙重角色，究竟以何角色發(fā)揮作用，則與起源細(xì)胞/組織/器官種類、腫瘤類型、YAP1的亞細(xì)胞定位、信號通路交互方式等因素有關(guān)。

表1 YAP1、P53在B-NHL和RHL中的表達(dá)Tab. 1 Positive expression of YAP1 and P53 in B-NHL and RHL (n, %)

雖然YAP1已成為近年來腫瘤的研究熱點(diǎn)，但迄今鮮見有關(guān)其在淋巴瘤方面的研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示YAP1在良性反應(yīng)性淋巴組織中廣泛表達(dá)，陽性細(xì)胞為彌漫分布于淋巴濾泡、濾泡間區(qū)的各階段淋巴細(xì)胞，其中以濾泡生發(fā)中心表達(dá)強(qiáng)度最高，但在成熟漿細(xì)胞中呈陰性表達(dá)，提示YAP1在成熟B細(xì)胞分化過程中發(fā)揮作用，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。在B-NHL中，YAP1在生物學(xué)行為相對惰性的SLL和MCL亞型中的表達(dá)情況，與在良性反應(yīng)性淋巴組織中的表達(dá)相似，均呈中-強(qiáng)度彌漫表達(dá)；而在侵襲性較高的DLBCL亞型中，38.8%的病例YAP1蛋白缺失、呈陰性表達(dá)。由于淋巴細(xì)胞在成熟過程中要經(jīng)歷很多階段，而淋巴瘤在許多方面重復(fù)著正常淋巴細(xì)胞的分化階段，因而淋巴瘤分類在一定程度上反映了對應(yīng)的正常分化階段的形態(tài)、遺傳學(xué)特征和免疫表型[7]；鑒于此，結(jié)合本研究中YAP1在RHL和B-NHL中表達(dá)的特點(diǎn)，進(jìn)一步表明YAP1在處女B細(xì)胞至漿細(xì)胞前的各分化階段(即處女B細(xì)胞→生發(fā)中心B細(xì)胞→記憶B細(xì)胞)中發(fā)揮重要作用。此外，由于YAP1在RHL的生發(fā)中心B細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，但在對應(yīng)生發(fā)中心B細(xì)胞起源的一些DLBCL中呈陰性表達(dá)，提示YAP1可能作為腫瘤抑制基因參與了部分DLBCL的發(fā)生發(fā)展。

p53基因定位于人類染色體的17p13.1，是重要的腫瘤抑制基因。該基因的突變或失活是多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素。迄今已證實(shí)至少50%的實(shí)體性腫瘤存在p53基因的缺失或突變。雖然在血液病和淋巴瘤中，p53缺失和突變的頻率沒有其他腫瘤高，但它與淋巴瘤發(fā)生、進(jìn)展、化療耐藥等密切相關(guān)，并且可能是侵襲性淋巴瘤的預(yù)后不良因子[23-24]。新近研究發(fā)現(xiàn)，p53與Hippo-YAP1通路之間存在交互作用，p53基因狀態(tài)可影響Hippo-YAP1通路的促癌或抑癌效應(yīng)的轉(zhuǎn)化。野生型P53蛋白能夠與YAP1啟動子結(jié)合從而激活YAP1轉(zhuǎn)錄，而YAP1蛋白作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，又能促進(jìn)p53基因轉(zhuǎn)錄，兩者相互作用形成正反饋調(diào)控環(huán)，參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤形成[25]。突變型P53蛋白則能夠與YAP1直接結(jié)合形成YAP1/突變型P53蛋白復(fù)合體，進(jìn)而與轉(zhuǎn)錄因子NF-Y結(jié)合形成一個(gè)多蛋白復(fù)合體，該復(fù)合體能夠與CCNA、CCNB和CDK1等基因的調(diào)控區(qū)相結(jié)合而增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)細(xì)胞增生和腫瘤形成[26-27]。本研究結(jié)果顯示，突變型P53蛋白在B-NHL表達(dá)的陽性率為16.7%，其中在DLBCL陽性率為18.4%，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[28]。雖然突變型P53蛋白在B-NHL中表達(dá)陽性率不高，但分析結(jié)果顯示它在B-NHL和RHL間表達(dá)有顯著差異，推測它可能在少數(shù)B-NHL中起到了促進(jìn)作用。另外，本研究數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)突變型P53蛋白表達(dá)與YAP1蛋白表達(dá)之間存在顯著相關(guān)性，表明突變型P53蛋白和YAP1可能通過不同的途徑和機(jī)制參與了部分B-NHL的發(fā)生發(fā)展。

綜上，本研究顯示B-NHL中存在Hippo通路的異常，YAP1蛋白可能作為腫瘤抑制因子參與了部分B-NHL的發(fā)生發(fā)展，但與突變型P53蛋白的表達(dá)無相關(guān)性，其具體作用機(jī)制尚有待從分子水平進(jìn)一步闡明。