SHH基因修飾的大鼠鼻黏膜外胚層間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

畢士奇， 呂德明， 楊開元， 戴瑤， 莊琴, 黃秋生， 張志堅(jiān)， 崔學(xué)文

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇， 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院血液科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001； 3. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001； 4. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院骨科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

外胚層間充質(zhì)干細(xì)胞(ectomesenchymal stem cells，EMSCs)是來源于胚胎時(shí)期神經(jīng)嵴(neural crest)的一種多能干細(xì)胞，主要分布于頭面部黏膜的固有層內(nèi)。EMSCs不僅保留多向分化潛能而且具有很強(qiáng)的增殖能力[1]。鼻腔黏膜包括呼吸部黏膜和嗅部黏膜，關(guān)于嗅黏膜干細(xì)胞和嗅鞘細(xì)胞修復(fù)中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究較多，并且取得了令人矚目的進(jìn)展。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)在大鼠和人的鼻腔呼吸黏膜固有層內(nèi)廣泛存在EMSCs，該細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)神經(jīng)外胚層干細(xì)胞標(biāo)志蛋白和中胚層干細(xì)胞標(biāo)志蛋白。與嗅鞘細(xì)胞比較，鼻呼吸黏膜來源的EMSCs取材更簡(jiǎn)便，且不損傷嗅覺功能[2]。EMSCs能夠在體外傳代和擴(kuò)增，其擴(kuò)增代數(shù)可達(dá)10代，擴(kuò)增的EMSCs 仍可高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白。

音猬因子(sonic hedgehog, SHH)是胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的一種多功能因子，在調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)分化中發(fā)揮重要作用[3]。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，SHH通過Patched-Smoothened-Gli 經(jīng)典的信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的突起向 SHH 高濃度區(qū)域延伸，并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞之間的突觸形成[4]。我們以往的研究表明，聯(lián)合使用全反式維甲酸(ATRA)、SHH、人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT3)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可在體外誘導(dǎo)EMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化[5]；然而，誘導(dǎo)過程需要消耗大量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。如果將EMSCs單獨(dú)移植到脊髓損傷部位，由于局部缺少高濃度的SHH等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，EMSCs的增殖分化能力有限，將影響其修復(fù)神經(jīng)損傷的效率。為了提高脊髓損傷部位SHH濃度，我們課題組選用殼聚糖納米顆粒作為載體，以京尼平為交聯(lián)劑交聯(lián)SHH，然后將SHH緩釋納米顆粒移植至大鼠脊髓損傷處，可促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)[6]。由此說明，維持脊髓損傷部位SHH濃度有利于神經(jīng)再生。

目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷最佳的治療方法仍是細(xì)胞移植[7]。如何在體外尋找與神經(jīng)組織生物相容性好，可分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子并可自身分化為神經(jīng)細(xì)胞的種子細(xì)胞，已成為目前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究中用SHH基因轉(zhuǎn)染EMSCs，使其能自分泌SHH，并提高其向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力。如將該細(xì)胞移植到脊髓損傷部位，其既可分泌SHH維持脊髓損傷部位SHH濃度，促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生，又可誘導(dǎo)自身分化為神經(jīng)細(xì)胞參與神經(jīng)組織修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

清潔級(jí)SD大鼠，50～150 g，雌雄不限，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：2211615001)。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、Neurobasal培養(yǎng)基及B27(美國(guó)Gibco 公司)；胰蛋白酶、ATRA、兔抗Smoothen抗體(美國(guó)Sigma公司)；兔抗巢蛋白、兔抗Connexin-43、兔抗軸突膜蛋白(GAP-43)、兔抗髓鞘堿性蛋白(MBP)、小鼠抗波形蛋白、小鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、Cy3和488偶聯(lián)抗兔、抗小鼠和抗山羊IgG抗體購(gòu)自博士德生物工程公司；山羊抗SHH和小鼠抗β-3微管蛋白(TUBB3)抗體(美國(guó)R&D公司)。SHH-GFP基因重組腺病毒的構(gòu)建由長(zhǎng)沙盈潤(rùn)公司提供技術(shù)支持。SHH-GFP引物設(shè)計(jì)如下，ShhN-gfp-f:AAAGAATTCGCCACCATGCTGCTGCTGCTGGCCAGATGT; ShhN-gfp-r:AAAGAATTCAGATTTGGCCGCCACGGAGTTC。

1.2 SD大鼠EMSCs的分離、培養(yǎng)和純化傳代

頸椎脫臼法處死SD大鼠，頭面部用碘伏滅菌后，無菌條件下經(jīng)鼻孔沿鼻腔向上至內(nèi)眥部剪開皮膚及鼻骨，顯露鼻腔，取出鼻中隔中下部分置于DMEM/F12中，剝離全層鼻黏膜，棄去鼻中隔軟骨[8]。PBS漂洗剝離黏膜組織，去除血液。用眼科剪充分剪碎黏膜組織，0.25%胰酶37 ℃消化15 min，置于10% 胎牛血清的DMEM/F12終止消化，離心去上清液。將沉淀的組織塊和細(xì)胞用10% 胎牛血清的DMEM/F12吹散，接種于培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2、95%濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；7 d 后將培養(yǎng)基和懸浮的組織吸出棄去，并補(bǔ)充新的培養(yǎng)基，每3天換液1次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行消化、傳代。

1.3 SHH基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染EMSCs

將上述第3代EMSCs接種于96孔培養(yǎng)板和6孔培養(yǎng)板內(nèi)，同時(shí)加入濃度為1%的293A細(xì)胞擴(kuò)增的SHH基因重組腺病毒液(具體方法略)，培養(yǎng)3 d后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，當(dāng)轉(zhuǎn)染率達(dá)85%時(shí)，用4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定96孔板內(nèi)細(xì)胞，對(duì)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(EMSCs)及SHH基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(SHH-EMSCs)進(jìn)行免疫熒光染色。用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)6孔板內(nèi)EMSCs及SHH-EMSCs細(xì)胞內(nèi)的SHH表達(dá)水平和培養(yǎng)液中的分泌型SHH的相對(duì)含量。

1.4 免疫熒光染色檢測(cè)SHH-EMSCs干細(xì)胞標(biāo)志蛋白

將上述4%多聚甲醛固定的EMSCs及SHH-EMSCs用PBS清洗3次，用0.3% Triton X-100 37 ℃孵育30 min，3% BSA 37 ℃孵育1 h，分別加入巢蛋白、波形蛋白、 Connexin- 43抗體(稀釋比為1 ∶100)。對(duì)照孔加入PBS， 4 ℃孵育8 h，PBS洗3次，加入和第一抗體相應(yīng)的Cy3標(biāo)記的第二抗體，37 ℃孵育2 h，PBS清洗，DAPI染核后甘油封片，用熒光顯微鏡(Zeiss Axio Observer; GmbH, 德國(guó))觀察拍照。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞及培養(yǎng)液中的SHH蛋白

蛋白樣品的收集方法如下：用50 μL RIPA裂解液(含1 μL復(fù)合蛋白酶抑制劑)4 ℃裂解6孔板內(nèi)的細(xì)胞10 min，加入等量電泳上樣緩沖液混勻后100 ℃煮沸冷卻后-80 ℃冷凍備用；收集6孔板內(nèi)培養(yǎng)基上清液，-20 ℃冷凍后，置于-80 ℃冷凍干燥機(jī)中干燥，稱取10 mg的凍干粉加入50 μL PBS(含1 μL復(fù)合蛋白酶抑制劑)，溶解后加入等量的電泳上樣緩沖液混勻后100 ℃煮沸冷卻后-80 ℃冷凍備用。蛋白質(zhì)印跡步驟如下：制備10%的分離膠和5%的積層膠, 以4 μL每泳道上樣, 電泳, 轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，用山羊抗SHH一抗37 ℃孵育2 h, TBST洗膜3次，每次5 min, HRP偶聯(lián)的二抗孵育1 h, TBST洗膜3次，每次5 min；以ECL-PLUS作為發(fā)光劑, 于分子成像系統(tǒng)Typhoon 9400 Imager上掃描蛋白條帶并測(cè)定其灰度。細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的相對(duì)水平選用細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白β-微管蛋白作為內(nèi)參。計(jì)算各泳道(各組)SHH蛋白條帶與β-微管蛋白條帶的灰度比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。培養(yǎng)基內(nèi)分泌型SHH含量只作定性觀察(培養(yǎng)基內(nèi)的β-微管蛋白含量極微不適合作為內(nèi)參)。

1.6 SHH-EMSCs向神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)分為4組：SHH-EMSCs誘導(dǎo)組、SHH-EMSCs正常培養(yǎng)組、EMSCs誘導(dǎo)組、EMSCs正常培養(yǎng)組。誘導(dǎo)組培養(yǎng)液為含5 % 胎牛血清, 2% B27，ATRA 0.5 μg/mL, TSA 20 ng/mL的Neurobasal培養(yǎng)液,對(duì)照組培養(yǎng)液為5% 胎牛血清 Neurobasal培養(yǎng)液。將第3代SHH-EMSCs和EMSCs接種于96和6孔板內(nèi), 完全貼壁后，加入誘導(dǎo)或非誘導(dǎo)培養(yǎng)基，3 d后均換為10% 胎牛血清 DMEM/F12完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 d。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。培養(yǎng)7 d后用4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，用GAP-43、TUBB3、MBP、GFAP的抗體對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色(染色過程同上)。蛋白質(zhì)印跡測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GAP-43、TUBB3、MBP、GFAP和Smoothen蛋白表達(dá)水平(蛋白收集和測(cè)定方法同上)。

1.7 SHH-EMSCs的體內(nèi)移植

SD大鼠麻醉后顯露T9-L1棘突及椎板，用特制止血鉗咬去T9-T12棘突及椎板。顯露脊髓，刺破硬脊膜，微量注射器吸取20 μL SHH-EMSCs懸液(含1×108個(gè)細(xì)胞)，傾斜60°進(jìn)針，緩慢注入，注射持續(xù)時(shí)間為5 min，注射完畢停留5 min退針。術(shù)畢，逐層縫合筋膜、肌肉和皮膚。連續(xù)肌注青霉素(5萬U/kg)3 d，動(dòng)物手術(shù)2周后用4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注固定，取出脊髓。用30%蔗糖脫水后進(jìn)行冰凍切片，片厚20 μm，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，2% BSA/0.01% Triton X-100室溫作用30 min，以兔抗TUBB3 抗體(1 ∶200)，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗3次，然后用Cy3標(biāo)記的熒光二抗(羊抗兔IgG，1 ∶100) 37℃ 孵育1 h，DAPI染核后，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞在脊髓內(nèi)存活和分化的情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

組內(nèi)采用

LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SHH基因轉(zhuǎn)染后EMSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的形態(tài)學(xué)觀察

SHH-EMSCs誘導(dǎo)組培養(yǎng)48 h后, 即可見部分細(xì)胞的胞體變圓，兩極可見短突起；培養(yǎng)3 d后部分細(xì)胞呈多極化。 培養(yǎng)7 d后，EMSCs誘導(dǎo)組可見很少量的神經(jīng)樣細(xì)胞，SHH-EMSCs誘導(dǎo)組可見較多神經(jīng)樣細(xì)胞。培養(yǎng)14 d后(圖1)，SHH-EMSCs誘導(dǎo)組出現(xiàn)較多數(shù)量的雙突起、多突起等多種形態(tài)的神經(jīng)樣細(xì)胞，部分突起可連接成網(wǎng)狀；EMSCs誘導(dǎo)組出現(xiàn)少量神經(jīng)樣細(xì)胞；EMSCs正常培養(yǎng)組未見明顯細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

圖1 誘導(dǎo)14 d后各組細(xì)胞形態(tài)觀察(倒置顯微鏡×100)

2.2 SHH-EMSCs的干細(xì)胞標(biāo)志蛋白及SHH蛋白的表達(dá)

原代EMSCs培養(yǎng)3 d,部分細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)較快。培養(yǎng)至第10 d可見大部分細(xì)胞呈魚群樣；免疫熒光染色結(jié)果顯示EMSCs表達(dá)巢蛋白、波形蛋白和Connexin-43,且表達(dá)率高達(dá)85%(圖2)。經(jīng)SHH基因轉(zhuǎn)染的EMSCs形態(tài)無明顯變化；免疫熒光染色結(jié)果顯示SHH-EMSCs仍然高表達(dá)巢蛋白、波形蛋白 和Connexin-43, 且表達(dá)率高達(dá)90%(圖3)；免疫印跡數(shù)據(jù)顯示SHH-EMSCs的SHH表達(dá)水平明顯高于EMSCs(圖4A)，并且SHH-EMSCs培養(yǎng)基上清液中可檢測(cè)到分泌型的SHH(圖4B)。

2.3 SHH-EMSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的驗(yàn)證

2.3.1 免疫熒光染色結(jié)果 對(duì)4組細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，可觀察到SHH-EMSCs誘導(dǎo)組GAP-43、TUBB3、MBP和Smoothen蛋白呈強(qiáng)陽性，GFAP表達(dá)陰性(圖 5)。同等曝光量的條件下其他3組細(xì)胞GAP-43、TUBB3、MBP、GFAP和Smoothen蛋白的表達(dá)均為陰性(染色結(jié)果未列出)。

圖2 EMSCs的巢蛋白、波形蛋白及Connexin-43蛋白表達(dá)(免疫熒光染色×100)

圖3 SHH-EMSCs的巢蛋白、波形蛋白及Connnexin-43(免疫熒光染色×100)

A. 細(xì)胞內(nèi)SHH蛋白，a:P<0.05，與EMSCs組比較；B. 培養(yǎng)上清液中SHH蛋白

圖4蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)SHH蛋白表達(dá)

圖5 免疫熒光檢測(cè)SHH-EMSCs誘導(dǎo)組神經(jīng)細(xì)胞分化標(biāo)志蛋白(×100)

2.3.2 蛋白質(zhì)印跡結(jié)果 SHH-EMSCs誘導(dǎo)組的GAP-43、TUBB3、MBP和Smoothen蛋白表達(dá)水平明顯高于其他3組(均P<0.01)；EMSCs誘導(dǎo)組與兩組未誘導(dǎo)組對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GFAP在4組細(xì)胞中的表達(dá)水平均較低且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

b: P<0.01,與其他3組比較

2.4 SHH-EMSCs在大鼠脊髓內(nèi)的存活及分化情況

SHH-EMSCs移植至脊髓內(nèi)2周，可見SHH-EMSCs依然存活且已遷移一段距離，并分泌SHH-GFP融合蛋白(綠色熒光顆粒)，移植細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白TUBB3(紅色熒光)，白色箭頭所示(圖7)。

3 討論

EMSCs是分布于頭面部的特殊類型的MSCs，起源于胚胎時(shí)期的神經(jīng)嵴，EMSCs取材簡(jiǎn)便、體外增殖能力強(qiáng)，具有多向分化潛能[9]。體外培養(yǎng)的EMSCs可定向誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞[10]。將EMSCs在體外誘導(dǎo)成雪旺樣細(xì)胞，與神經(jīng)球樣細(xì)胞搭載Firbrin膠共同移植到脊髓損傷模型的SD大鼠體內(nèi)，顯示EMSCs可促進(jìn)神經(jīng)再生，提示該細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞治療方面具有良好的應(yīng)用前景[2]。

圖7 SHH-EMSCs細(xì)胞體內(nèi)存活及TUBB3蛋白的表達(dá)(免疫熒光染色×100)

SHH是哺乳動(dòng)物信號(hào)通路家族中的3種蛋白質(zhì)之一，它不僅是調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物器官發(fā)生的形態(tài)形成因子, 而且在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生和分化過程中具有重要作用[11]。大量研究表明SHH可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元[12]；陳謙等[13]利用SHH聯(lián)合NT-3成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化；研究發(fā)現(xiàn)SHH核心受體BOC通過與ABL和JNK激活的相互作用調(diào)節(jié)神經(jīng)元分化和神經(jīng)軸突生長(zhǎng)[14]；SHH可促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷后的修復(fù)[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，SHH基因修飾的EMSCs保留了原有的干細(xì)胞特性，并增強(qiáng)了向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力。GAP-43參與軸突再生[17], TUBB3是神經(jīng)元微管家族蛋白[18]，GAP-43和TUBB3是經(jīng)典的神經(jīng)元細(xì)胞表面標(biāo)志物；MBP是成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物并且與髓鞘的脂質(zhì)膜相互作用而維持髓鞘結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[19]，GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物[20]。SHH-EMSCs經(jīng)過ATRA誘導(dǎo)后，其高表達(dá)GAP-43、TUBB3和MBP，但GFAP表達(dá)較弱，說明SHH-EMSCs具有神經(jīng)元樣細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的偏向。值得一提的是在本研究中所用的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并未加入任何神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子即可實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)誘導(dǎo)分化。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，SHH-EMSCs細(xì)胞中至少存在兩種形式的高濃度SHH，即游離型的SHH和胞內(nèi)型的SHH。游離型的SHH是EMSCs分泌進(jìn)入培養(yǎng)基的活性形式，可通過與EMSCs自身或周邊細(xì)胞膜上的受體如BOC，Patched/Smoothen 等結(jié)合，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的增殖和分化[21-22]。胞內(nèi)型SHH是EMSCs內(nèi)的合成和儲(chǔ)存形式[23]，SHH-EMSCs細(xì)胞裂解液內(nèi)的高水平SHH表明，通過腺病毒染的SHH基因可在EMSCs內(nèi)高表達(dá)，并能分泌到胞外。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明移植到脊髓內(nèi)的SHH-EMSCs可長(zhǎng)時(shí)間存活，并分泌SHH-GFP融合蛋白。由此提示，SHH-EMSCs移植到脊髓內(nèi)可提高損傷脊髓局部的SHH濃度，改善脊髓損傷部位的微環(huán)境，有利于神經(jīng)再生。

綜上所述，SHH基因修飾的EMSCs具有較強(qiáng)的向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的潛能，有望成為移植治療脊髓損傷的一種新的種子細(xì)胞。