瀘州枳殼揮發(fā)油的取提工藝優(yōu)化

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1.瀘州宇龍枳殼枳實研究院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000

枳殼是2015年版《中國藥典》一部收錄的常用中藥，來源為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實。7月果皮尚綠時采收，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥。枳殼性苦、辛、酸、溫，具有理氣寬中、行滯消脹的功效，主治胸脅氣滯，脹滿疼痛，食積不化，痰飲內(nèi)停；胃下垂，脫肛，子宮脫垂等病癥[1]。枳殼的主要化學(xué)成分有為黃酮、揮發(fā)油和生物堿等。揮發(fā)油是枳殼理氣、行滯、鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌作用的重要成分，現(xiàn)已經(jīng)鑒定出揮發(fā)油成分種類達(dá)100多種[2-3]。目前主要是對枳殼及其揮發(fā)油化學(xué)成分的研究報道較多，而對揮發(fā)油的提取工藝研究報道較少，故本試驗采用水蒸氣蒸餾法提取枳殼揮發(fā)油，優(yōu)化揮發(fā)油的提取工藝，為枳殼揮發(fā)油的研究與開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料 枳殼(產(chǎn)地：四川瀘州，批號20180206，四川天植中藥股份有限公司)經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)稅丕先教授鑒定為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL. 及其栽培變種的干燥未成熟果實，陰干，粉碎后，分別過藥典1號篩(10目)、2號篩(24目)、3號篩(50目)，備用；水為純凈水。

1.2 儀器 YP15001型電子天平(常州市衡正電子儀器有限公司)，ZNHW型電熱套(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，DSY-9002型高速萬能粉碎機(jī)(永康市九順瑩商貿(mào)有限公司)，水蒸氣蒸餾裝置(自行安裝)，揮發(fā)油測定器，1、2、3、4號藥典篩。

2 方法

2.1 提取方法 以水蒸氣蒸餾法為提取方法提取枳殼中的揮發(fā)油。將粉碎細(xì)度、提取時間以及加水量作為考察因素，指標(biāo)為揮發(fā)油的得率，按照2015版《中國藥典》(四部)里面的通則“2204揮發(fā)油測定法”中的甲法提取[1]。分別精確稱取粉碎細(xì)度不同的枳殼藥粉各100g，放入1000mL圓底燒瓶中，加一定比例的水與若干粒沸石，用玻璃棒攪拌混合后，將圓底燒瓶置于電熱套中，將揮發(fā)油測定器與回流冷凝管連接在圓底燒瓶上。自冷凝管上端加入一定量的水，當(dāng)揮發(fā)油測定管充滿水并有水溢入圓底燒瓶內(nèi)時停止加水。將圓底燒瓶緩慢加熱，直到圓底燒瓶中的液體沸騰，并保持一定時間的微沸狀態(tài)，直到測定管中揮發(fā)油的量沒有增加為止。之后停止加熱并放置一小段時間之后，通過將揮發(fā)油測定器下端的活塞打開進(jìn)行排水，保持排水速度較緩慢，直到揮發(fā)油的油層上端在0刻度線上5 mm處時停止排水。放置于室溫條件下，等待揮發(fā)油冷卻，冷卻時間為1 h左右。開啟活塞，使揮發(fā)油測定器中的下層液體緩慢排出，直到油層上端凹液面達(dá)到0刻度線，讀出揮發(fā)油體積并記錄數(shù)據(jù)，計算揮發(fā)油得率，計算公式如下[9]：

揮發(fā)油得率(%) =(V(mL)/M(g))×100% (V：揮發(fā)油體積 M：枳殼粉末的質(zhì)量)

2.2 正交試驗設(shè)計 因水蒸氣蒸餾法裝置簡易、操作方便，并且能得到較為純凈的高質(zhì)量揮發(fā)油。故此次正交試驗采用該方法提取枳殼揮發(fā)油，測得揮發(fā)油提取率，并以此為檢測指標(biāo)，對揮發(fā)油的影響因素進(jìn)行考察，考察的因素[10]包括：粉碎細(xì)度(A)、加水量(B)、提取時間(C)。將這3個影響因素作為三因素，設(shè)置三水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗，確定揮發(fā)油的最佳提取條件。具體因素及水平見表1[11]。

表1 試驗-因素水平表

3 結(jié)果

3.1 正交實驗結(jié)果 取不同粉碎細(xì)度的藥材，根據(jù)表2的設(shè)計進(jìn)行正交試驗，記錄數(shù)據(jù)并對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。由表2、3可知，對揮發(fā)油提取率影響較顯著的因素為因素A，對于因素A，K1>K2>K3，由此選擇水平1，即粉碎細(xì)度為過10目篩。因素B對揮發(fā)油得影響不顯著性，對于因素B，K2>K1>K3，由此選擇水平2，即加水量為8倍量。因素C對揮發(fā)油得影響不顯著性，對于因素C，K2>K1>K3，由此選擇水平2，即提取時間為7 h。所以在A1B2C2條件下，即使用過10目藥典篩的枳殼粉末，加8倍量的水連續(xù)提取7h時，枳殼揮發(fā)油的提取率最高。

表2 正交試驗設(shè)計表

表3 方差分析表

3.2 驗證試驗 精確稱取過10目藥典篩的枳殼粉末100g 3份，加8倍量的純化水，水蒸氣蒸餾7 h，利用所讀取的揮發(fā)油體積，計算出揮發(fā)油得率如下：0.48%、0.50%、0.51%，平均得率約為0.50%，RSD為1.47%。結(jié)果說明，該揮發(fā)油提取方法有穩(wěn)定性高和重復(fù)性好的優(yōu)點。

4 討論

4.1 實驗方法的選擇 枳殼為中醫(yī)上常用的理氣藥，主要用于治療食積不化，痰飲內(nèi)停，胸脅氣滯，脹滿疼痛等。揮發(fā)油是枳殼三大有效成分之一。枳殼揮發(fā)油主要是由檸檬烯等芳香類化合物構(gòu)成，此外，還含有其他單萜、倍半萜及其含氧衍生物等，共同構(gòu)成了枳殼理氣藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)揮發(fā)油不溶于水、相對密度小于水等理化性質(zhì)，因此，本實驗選擇水蒸氣蒸餾法作為提取方法對枳殼揮發(fā)油進(jìn)行提取。

4.2 粉碎細(xì)度對實驗的影響 本文采用正交試驗法，不僅優(yōu)化了枳殼揮發(fā)油水蒸氣蒸餾法的提取工藝，而且確定了提取工藝的最佳提取條件。實驗數(shù)據(jù)表明，該提取方法有操作簡單、安全可行以及重復(fù)性好等優(yōu)點。由試驗結(jié)果可知，在實驗室使用電熱套進(jìn)行加熱處理，對枳殼揮發(fā)油進(jìn)行提取的試驗中，影響枳殼揮發(fā)油提取率的關(guān)鍵因素是：枳殼粉末的粉碎細(xì)度，當(dāng)枳殼粉碎度達(dá)到一定程度的時候，提取溶劑更容易進(jìn)入枳殼的組織細(xì)胞間隙中間，從而使藥材發(fā)生膨脹，以使細(xì)胞內(nèi)外液的交換速度加快，而利于揮發(fā)油的提取[12]。

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，保存在自封袋枳殼粉末樣品，揮發(fā)油的提取率隨存放時間的延長而降低，當(dāng)枳殼粉碎后立即使用，其揮發(fā)油的提取率最大，在放置5 d后，揮發(fā)油的提取率大大降低。這可能是由于枳殼揮發(fā)油油室主要分布于果皮中[13]，粉碎后油室直接暴露于空氣里，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油散失。所以建議提取揮發(fā)油時粉碎后立即使用。

此外，枳殼粉碎細(xì)度是影響枳殼揮發(fā)油質(zhì)量的主要因素，然而2015年版《中國藥典》通則2204中規(guī)定揮發(fā)油提取時粉末需過二號至三號篩，沒有明確規(guī)定枳殼的粉碎度，為了對枳殼揮發(fā)油更好地提取和利用，建議選用過一號藥典篩、而不能通過二號藥典篩的粗粉進(jìn)行枳殼揮發(fā)油的提取。

本次試驗中，與文獻(xiàn)報道相比較，揮發(fā)油的提取率較低，其原因可能是由于在使用粉碎機(jī)進(jìn)行枳殼粉碎時，將果皮中的油室破壞了，致使油室直接暴露在空氣中，加大了揮發(fā)油與空氣的接觸面積。另外打粉用時較長，并且在機(jī)器高速研磨過程中有大量的熱量產(chǎn)生。這兩個因素都會加快枳殼揮發(fā)油的損失。為了減少在打粉過程中揮發(fā)油的損失，可采用先將枳殼用水軟化，然后在水中將枳殼搗碎，再將枳殼與水的混合物一起進(jìn)行提取的的方法提取揮發(fā)油[14]。這樣操作可以有效減少打粉時揮發(fā)油損失。

4.3 藥材對實驗的影響 新鮮枳殼帶有大量水分，對于枳殼的銷售、運輸和儲藏十分不便，故此新鮮枳殼必須在原產(chǎn)地進(jìn)行干燥處理。干燥處理過程中常采用烘烤晾曬以及飲片生產(chǎn)所需的干燥處理，這些處理均會導(dǎo)致?lián)]發(fā)油散失。并且在儲藏過程中，若保存不當(dāng)，揮發(fā)油也會有些許散失。因此可以采用枳殼與產(chǎn)地加工與炮制生產(chǎn)一體化工藝來減少揮發(fā)油的損失[15]。在提取時用新鮮枳殼切碎提取可避免因干燥、運輸過程等因素造成的揮發(fā)油損失而使揮發(fā)油提取率降低。

4.4 糊化現(xiàn)象對實驗的影響 在進(jìn)行50目枳殼粉末、6倍加水量連續(xù)提取9 h的實驗時，發(fā)生枳殼糊化的現(xiàn)象，而其他8組實驗則未發(fā)生糊化的現(xiàn)象，可能有以下原因：①由于粉末過細(xì)，吸水能力過強(qiáng)，導(dǎo)致粉末不能與水混合均勻，使燒瓶下部的水過少，從而導(dǎo)致枳殼粉末糊化；②在整個提取過程中，因為粉末和水的混合物不均勻，加上提取溫度過高，致使燒瓶底部局部溫度過高，從而發(fā)生糊化。

為避免糊化現(xiàn)象發(fā)生，應(yīng)該避免使用過細(xì)的粉末的進(jìn)行提取，適當(dāng)增加用水量，控制提取的溫度。在提取過程中應(yīng)該時刻注意觀察揮發(fā)油的顏色，枳殼揮發(fā)油的正常顏色為淡黃色，發(fā)生糊化時，揮發(fā)油的顏色呈焦黃色。糊化發(fā)生時，應(yīng)立即停止對裝置加熱，避免進(jìn)一步糊化，而使揮發(fā)油的品質(zhì)降低。

4.5 加水量對實驗的影響 加水量對枳殼揮發(fā)油提取率的影響較小，但也有一定的影響，從實驗結(jié)果中可以看出，8倍加水量可以提高枳殼揮發(fā)油的提取率。這可能是因為：①枳殼的吸水能力較強(qiáng)，加水量過少，只夠枳殼吸水膨脹，不能產(chǎn)生足夠的水蒸氣，導(dǎo)致冷凝水減少，因此揮發(fā)油的提取率降低；②適量的水可以增加枳殼粉末之間的空隙，揮發(fā)油更易與水蒸氣混合，使水蒸氣更易將揮發(fā)油攜帶入冷凝器進(jìn)行冷凝。

過量的水則會消耗較多的熱量，不利于揮發(fā)油的提取，并且過量的水也是對水資源的浪費，在進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)時，則會產(chǎn)生不必要的能源和資源的支出，增加企業(yè)的負(fù)擔(dān)。因此，綜合考慮，8倍量的水適合于揮發(fā)油的提取。

4.6 提取時間和浸泡時間對實驗的影響 提取時間對揮發(fā)油的提取率幾乎沒有影響，但從實驗結(jié)果可以看出，提取時間為5 h的揮發(fā)油得率明顯低于提取時間為7 h和9 h，而提取時間為7 h和提取時間為9 h之間揮發(fā)油得率并沒有明顯差距，因此從節(jié)約成本上考慮，選用提取時間為7 h為佳。

干燥的枳殼遇水膨脹，通過一段浸泡時間，可以使水充分進(jìn)入細(xì)胞間隙，但是在本實驗中并未考慮浸泡時間對枳殼揮發(fā)油提取率的影響。這是因為已有的文獻(xiàn)報道中報道過浸泡時間對揮發(fā)油的提取并不會產(chǎn)生影響，所以實驗設(shè)計時沒有考慮浸泡時間對揮發(fā)油提取率的影響。此外，通過在實驗中的觀察，枳殼的吸水能力十分迅速，在加熱過程中就能完全膨脹，不需要額外的浸泡時間。

除了枳殼外，中藥材中還有枳實、陳皮、青皮、核瓣的揮發(fā)油成分也與枳殼相似[16-17]，故本實驗可以為含有相似成分的藥用或食用植物的揮發(fā)油的提取方法等方面提供參考。

綜上，根據(jù)正交實驗結(jié)果和方差分析結(jié)果可以看出，所有影響因素中，對枳殼揮發(fā)油提取率影響最大的因素是粉碎細(xì)度，而對枳殼揮發(fā)油的提取率影響較小的影響因素是提取時間以及提取時加入的蒸餾水量，過10目藥典篩的枳殼粉末的揮發(fā)油平均提取率高于過24目篩和50目篩的藥材粉末；8倍加水量的揮發(fā)油平均提取率高于6倍、10倍加水量；提取時間為7 h的揮發(fā)油平均提取率高于提取時間為5 h和9 h。因此，本實驗所得結(jié)論為：將枳殼粉末過10目篩，加入8倍量的水，連續(xù)提取7 h為枳殼揮發(fā)油的最佳提取工藝，此時枳殼揮發(fā)油的得率最高。