B7-H4和B7-H6在卵巢癌中的表達(dá)及意義

章曉潔, 李懷芳*, 初 磊, 程 允, 梅麗艷, 周士華

1. 上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 2019082. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 2000653. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院婦科， 南京 210029

卵巢惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅女性生命安全的腫瘤。美國(guó)2018年癌癥發(fā)病及死亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果[1]顯示，卵巢惡性腫瘤是致死人數(shù)最多的婦科腫瘤。由于卵巢解剖位置較深，且卵巢癌缺乏特異性癥狀及體征，臨床上難以早期發(fā)現(xiàn)、及時(shí)診治，大部分的患者就診時(shí)已發(fā)展至晚期，5年生存率不足30%[2]。因此，尋找新的生物靶點(diǎn)，為卵巢癌的早診早治、預(yù)后評(píng)價(jià)及靶向治療提供依據(jù)，有重要的臨床意義。

近年來，研究[3]表明，協(xié)同刺激途徑參與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中包括卵巢惡性腫瘤。協(xié)同刺激分子的異常表達(dá)可以抑制T 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。B7-H4和B7-H6均屬于B7家族，是重要的協(xié)同刺激分子。近年來的研究[5-11]表明，這兩種蛋白在多種人類腫瘤組織中異常表達(dá)，包括宮頸癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、星形細(xì)胞瘤等，并直接影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，輔助腫瘤免疫逃逸，從而影響患者預(yù)后。然而，B7-H4及B7-H6在卵巢癌中的研究很少。

因此，本研究通過分析B7-H4和B7-H6在卵巢腫瘤中的表達(dá)，及其與患者臨床病理特征的關(guān)系，探討這兩種蛋白在卵巢癌中的作用及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院2015年4月至2018年6月收治的卵巢惡性腫瘤58例及卵巢良性腫瘤43例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行手術(shù)、放化療、激素及免疫治療，按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2014卵巢惡性腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期。58例卵巢惡性腫瘤包括23例漿液性癌、12例透明細(xì)胞癌、9例苗氏管癌、7例子宮內(nèi)膜樣癌及7例印戒細(xì)胞癌。43例卵巢良性腫瘤包括10例畸胎瘤、10例黏液性囊腫、10例子宮內(nèi)膜異位囊腫、5例黃體囊腫、4例漿液性囊腫及4例纖維瘤。惡性組患者年齡28～86歲，平均53.62歲；良性組患者年齡25～76歲，平均51.14歲。兩組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 免疫組織化學(xué) 將同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院病理科采集的組織蠟塊制作成組織切片，進(jìn)行DAB免疫組織染色。60℃恒溫箱烘烤，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，0.01 mmol/L檸檬酸鈉緩沖溶液抗原修復(fù)，含3%過氧化氫的甲醇溶液處理后，孵一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。將B7-H4和B7-H6抗體按1∶1 000稀釋于抗原稀釋液中，200 μL覆蓋在組織切片，4℃孵育過夜；PBS清洗后，二抗(美國(guó)Vector公司)按1∶1 000稀釋于抗原稀釋液中，覆蓋切片，4℃孵育過夜。DAB顯色，脫水，脫脂，中性樹膠封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 在200倍鏡下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞；共計(jì)500個(gè)細(xì)胞。按照染色陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行A評(píng)級(jí)：0級(jí)(0%)、1級(jí) (<10%)、2級(jí)(10%～50%)、3級(jí) (>50%)；按陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度進(jìn)行B評(píng)級(jí)：0級(jí) (無著色)、1級(jí) (淡黃色，+)、2 (黃色，)、 3 級(jí)(棕褐色，)。免疫組化評(píng)分(IHS)=A×B；IHS<2為染色陰性，IHS≥2為染色陽性。B7-H4和B7-H6蛋白共同表達(dá)為雙陽，兩者之一表達(dá)為單陽，均未表達(dá)為雙陰。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS 9.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，組間進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni校正法；對(duì)于不滿足χ2檢驗(yàn)條件的計(jì)數(shù)資料，進(jìn)行Fisher確切概率法分析；組間等級(jí)計(jì)數(shù)資料比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 B7-H4和B7-H6在卵巢良、惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色(圖1、圖2)顯示：B7-H4和B7-H6蛋白陽性著色為棕黃色顆粒，在卵巢良性腫瘤中不表達(dá)或低表達(dá)。B7-H4在卵巢良性腫瘤中的A評(píng)級(jí)為1、B評(píng)級(jí)1，IHS為1；B7-H6在卵巢良性腫瘤中的A評(píng)級(jí)為1、B評(píng)級(jí)1，IHS為1。

B7-H4和B7-H6蛋白在卵巢癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜表達(dá)，呈現(xiàn)強(qiáng)或中等強(qiáng)度染色，呈灶狀或片狀分布，間質(zhì)細(xì)胞中無或弱染色。B7-H4在卵巢惡性腫瘤中的A評(píng)級(jí)為3、B評(píng)級(jí) 3，IHS為9；B7-H6在卵巢惡性腫瘤中的A評(píng)級(jí)為3、B評(píng)級(jí) 3，IHS為9。

2.2 B7-H4和B7-H6蛋白在卵巢良、惡性腫瘤中的表達(dá)率 58例卵巢惡性腫瘤標(biāo)本中，48例(82.76%)表達(dá)B7-H4，46例(79.31%)表達(dá)B7-H6。43例卵巢良性腫瘤標(biāo)本中，6例(13.95%)表達(dá)B7-H4，7例(16.28%)表達(dá)B7-H6。卵巢惡性腫瘤中，B7-H4和B7-H6蛋白至少其中之一陽性的比例為91.38%(53/58)；卵巢良性腫瘤中，B7-H4和B7-H6蛋白至少其中之一陽性的比例為27.91%(12/43)。B7-H4和B7-H6蛋白在卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)率高于卵巢良性腫瘤(P<0.000 1)。

2.3 B7-H4和B7-H6蛋白的表達(dá)與卵巢惡性腫瘤臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 結(jié)果(表1)表明：B7-H4和B7-H6在<55歲組的表達(dá)率高于55歲及以上年齡組(P<0.05)。兩者在不同組織類型間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩者在p53蛋白陽性標(biāo)本中的表達(dá)率高于p53蛋白陰性標(biāo)本(P<0.05)。兩者在不同組織分化程度、FIGO臨床分期及CA125表達(dá)情況間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 B7-H4在卵巢良、惡性腫瘤中的表達(dá)

圖2 B7-H6在卵巢良、惡性腫瘤中的表達(dá)

表1 B7-H4和B7-H6表達(dá)與卵巢惡性腫瘤臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系n(%)

3 討 論

B7家族成員是重要的協(xié)同刺激分子，對(duì)T細(xì)胞活化、B細(xì)胞活化、細(xì)胞因子產(chǎn)生、某些分子和抗體的產(chǎn)生發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。B7-H4是T細(xì)胞免疫應(yīng)答負(fù)性調(diào)控基因，通過阻止T細(xì)胞的活化來抑制細(xì)胞因子的分泌，負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[12]。B7-H6能促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)釋放腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)，從而殺傷靶細(xì)胞[13]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4在宮頸癌[5]、胃癌[6]、非小細(xì)胞肺癌[7]和胰腺癌[8]等惡性腫瘤中過度表達(dá)，為潛在的治療靶點(diǎn)[14]；B7-H6在胃癌[9]、非小細(xì)胞肺癌[10]和星形細(xì)胞瘤[11]等惡性腫瘤中均有表達(dá)，并在荷瘤小鼠中取得顯著的靶向治療效果[15]。B7-H4和B7-H6在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用正日益受到關(guān)注，通過深入研究，有望成為新的靶向治療方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢惡性腫瘤中，B7-H4和(或)B7-H6蛋白的表達(dá)率為91.38%，高于其在卵巢良性腫瘤中的表達(dá)率(27.91%，P<0.05)，提示其與卵巢惡性腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，B7-H4和(或)B7-H6蛋白的表達(dá)率與患者年齡、組織類型、p53蛋白表達(dá)情況有關(guān)(P<0.05)，但未顯示其與組織分化程度、FIGO臨床分期及CA125表達(dá)情況的相關(guān)性，可能與樣本量較小有關(guān)。此外，本研究中的標(biāo)本均為石蠟標(biāo)本，由于包埋固定劑與抗原交聯(lián)作用，會(huì)封閉一部分抗原，且固定時(shí)間越久，抗原封閉的越多，使弱表達(dá)的抗原呈現(xiàn)假陰性，也可能導(dǎo)致結(jié)果偏倚。

綜上所述，B7-H4和B7-H6蛋白在卵巢良、惡性腫瘤中的表達(dá)存在差異，并與惡性腫瘤患者年齡、組織類型、p53蛋白表達(dá)相關(guān)，提示這兩種蛋白參與卵巢惡性腫瘤的發(fā)病。此外，近年來已有研究獲得B7家族靶向治療腫瘤的證據(jù)[14-15]，但確切作用機(jī)制尚不清楚，須加大樣本量進(jìn)行深入的體內(nèi)及體外研究。研發(fā)針對(duì)B7-H4和B7-H6的卵巢惡性腫瘤靶向藥物，聯(lián)合經(jīng)典的治療方法，有望為卵巢癌提供新的治療方案，進(jìn)而提高患者的生存率。