15-脫氧-Δ12,14-前列腺素J2對(duì)大鼠酸性胃內(nèi)容物吸入性肺損傷的保護(hù)作用

施勁東， 隆 玄， 符翠萍， 李建楠， 謝 娟， 施天昀， 梅周芳， 揭志軍， 李善群*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院呼吸科，上海 2002402. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200032

吸入性肺損傷是危重病患者的常見并發(fā)癥之一，可迅速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)。臨床上常見的吸入性肺損傷主要由胃酸、食物顆粒等胃內(nèi)容物反流誤吸所致，目前尚缺少有效的治療方法，導(dǎo)致其發(fā)病率和死亡率居高不下。胃酸及胃內(nèi)顆粒物是胃內(nèi)容物的主要成分，吸入后導(dǎo)致雙相肺損傷，早期主要為由酸介導(dǎo)的化學(xué)損傷，后期主要為由炎癥細(xì)胞、炎癥因子介導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[1-2]。因此，降低或阻斷酸性胃內(nèi)容物吸入性肺損傷時(shí)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能是提高該病搶救成功率的關(guān)鍵。

研究[3]表明，前列腺素類化合物15-脫氧-Δ12,14-前列腺素J2(15 -deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2，15d-PGJ2)能抑制機(jī)體的炎癥及氧化應(yīng)激損傷。在內(nèi)毒素和博來霉素誘導(dǎo)的ARDS和感染性休克動(dòng)物模型中，15d-PGJ2能夠通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)或抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、轉(zhuǎn)錄因子-1(AP-1)等途徑，發(fā)揮肺保護(hù)作用[4-7]。本研通過建立酸性胃內(nèi)容物所致大鼠肺損傷模型，進(jìn)一步探討15d-PGJ2能否減輕肺損傷程度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠25只，體質(zhì)量200～250 g，購自復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房。動(dòng)物由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心于SPF級(jí)條件下飼養(yǎng)，自由攝水、飲食。

1.2 酸性胃內(nèi)容物懸液制備 酸性胃內(nèi)容物顆粒懸液(combined acid and gastric particles，CAGP)的制備方法參照文獻(xiàn)[8]：將用于提取胃內(nèi)容物的5只SPF級(jí)雄性SD大鼠經(jīng)腹腔注射20%烏拉坦麻醉(7.5 mL/kg)，待大鼠安靜后將其仰臥置于手術(shù)臺(tái)板上，固定頭部與四肢；腹部備皮消毒，切開腹部皮膚，暴露大鼠胃并用手術(shù)剪切開，收集胃內(nèi)容物；用0.9%氯化鈉液沖洗胃內(nèi)容物3次，然后外科紗布過濾，以去除胃內(nèi)大分子顆粒、膽鹽等；過濾液在高壓蒸汽下消毒滅菌25 min，以800×g在室溫下離心2 min；棄去上清液，進(jìn)一步去除胃內(nèi)膽鹽等物質(zhì)，收集離心所得沉淀物，稱重，用pH 為1.25的鹽酸溶液(經(jīng)0.2 μm無菌一次性針頭濾器過濾)重懸，制成濃度為20 mg/mL的酸性胃內(nèi)容物懸液。

1.3 吸入性肺損傷模型的建立及干預(yù)治療 將20只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，每組10只。所有大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛按4 mL/kg進(jìn)行麻醉，待大鼠安靜后將其仰臥置于無菌手術(shù)臺(tái)板上，固定頭部與四肢，使臺(tái)板傾斜30°。頸部備皮消毒，于中線做約8 mm小切口，分開筋膜后，游離甲狀腺并用血管鉗分開頸前肌，暴露氣管。將14G靜脈套管針插入氣管至隆突上0.5～1 cm，拔出針心，套管針連接于1 mL注射器，向氣管內(nèi)緩慢滴注制備好的CAGP (1.5 mL/kg)。滴注后取下套管針，保持臺(tái)板傾斜的同時(shí)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)大鼠，使注射的酸性胃內(nèi)容物懸液均勻分布至大鼠雙側(cè)肺。滴注CAGP后即刻，治療組腹腔注射15d-PGJ2(1 mg/kg)，對(duì)照組腹腔注射相同體積的PBS。用縫線分別縫合氣管與頸部切口，使大鼠正常呼吸，并在室溫下自行蘇醒。分別于滴注CAGP后4 h和12 h，每組各取5只大鼠終止實(shí)驗(yàn)，并采集標(biāo)本。

1.4 標(biāo)本采集和檢測(cè)方法

1.4.1 血?dú)夥治?損傷后4 h和12 h，經(jīng)腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠。消毒后打開腹腔，將腹腔內(nèi)腸管翻至一側(cè)，暴露出腹主動(dòng)脈。用事先肝素化的1 mL注射器抽取腹主動(dòng)脈血0.5 mL后，立即用止血鉗夾閉腹主動(dòng)脈，以避免動(dòng)脈血噴射。抽出的動(dòng)脈血即刻用血?dú)夥治鰞x進(jìn)行動(dòng)脈血氧分壓(arterial partial pressure of oxygen, PaO2)檢測(cè)。

1.4.2 血清采集和肺濕重/干重比值(wet-to-dry weight ratios, W/D)測(cè)定 大鼠行血?dú)夥治龊?，剪開腹主動(dòng)脈放血處死，采集腹腔內(nèi)積血，分離血清凍存待檢。放血后迅速打開胸腔，結(jié)扎右側(cè)主支氣管，取出右肺上葉，用吸水紙吸干其表面液體后，于電子天平秤上稱其質(zhì)量，記錄為濕重。將稱量好的右肺上葉置于60℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)72 h以上，至其質(zhì)量不再發(fā)生變化后，再次稱重，記錄為干重。計(jì)算前后兩次的比，即W/D。

1.4.3 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的收集、蛋白測(cè)定、細(xì)胞計(jì)數(shù) 對(duì)大鼠左肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗。用16G插管針氣管插管，用注射器取1.5 mL無菌冷PBS行支氣管肺泡灌洗術(shù)3次。收集的BALF于4 ℃離心機(jī)250×g離心10 min，留取上清液于-20 ℃凍存。用BCA法(試劑盒購自碧云天公司)測(cè)定大鼠BALF上清液中總蛋白濃度，以觀察大鼠肺泡內(nèi)蛋白滲出情況。操作方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

細(xì)胞沉淀用0.5 mL PBS重懸，吸取20 μL用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。余懸液在TXT3細(xì)胞涂片上于離心機(jī)中250×g離心10 min，使細(xì)胞均勻平鋪于載玻片上，晾干后，用瑞-姬氏染液進(jìn)行快速染色，在高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4.4 肺組織病理學(xué)檢測(cè) 將大鼠左肺用4 % 多聚甲醛充盈，結(jié)扎左側(cè)主支氣管后放入4 ℃的4 % 多聚甲醛中固定，3 d后進(jìn)行包埋、切片和蘇木精-伊紅(H-E)染色，在200倍視野下觀察、拍照。由未參與實(shí)驗(yàn)的病理科醫(yī)師分別在低倍和高倍視野下進(jìn)行觀察和炎癥程度評(píng)分，參考文獻(xiàn)[9-10]。

1.4.5 BALF和血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor -α, TNF-α)濃度測(cè)定 采用ELISA法檢測(cè)BALF上清液和血清中的TNF-α濃度，試劑盒購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。

2 結(jié) 果

2.1 肺部H-E染色和PaO2結(jié)果(圖1、表1)表明：與對(duì)照組相比，損傷后4 h和12 h，治療組炎癥程度明顯下降，PaO2明顯改善，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 兩組大鼠肺組織H-E染色結(jié)果比較

表1 兩組大鼠炎癥和肺功能相關(guān)指標(biāo)比較n=5,

PaO2：動(dòng)脈血氧分壓；W/D：肺組織濕重/干重比值；BALF：支氣管肺泡灌洗液；TNF-α：腫瘤壞死因子-α.*P<0.05與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)相比

2.2 肺損傷程度 結(jié)果(表1)表明：損傷后4 h、12 h，治療組肺部滲出(W/D)與蛋白滲漏(總蛋白)均較對(duì)照組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 BALF中白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù) 結(jié)果(表1)表明：損傷后4 h、12 h，治療組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 BALF和血清中TNF-α濃度 結(jié)果(表1)表明：損傷后4 h、12 h，治療組BALF和血清中TNF-α濃度均較對(duì)照組下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

胃內(nèi)容物誤吸是ARDS的主要病因之一。在年老體弱、酗酒、顱腦創(chuàng)傷、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等危重患者中，吸入性肺損傷發(fā)生率更高[11-12]。與其他因素所致的ARDS不同，酸性胃內(nèi)容物吸入性肺損傷是一個(gè)雙相過程：早期主要為酸液介導(dǎo)的化學(xué)性損傷，一般發(fā)生于損傷后3 h之內(nèi)；后期為吸入的胃內(nèi)容物引發(fā)由炎癥細(xì)胞和炎癥因子介導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，此階段的損傷程度更為劇烈，損傷后4～6 h達(dá)高峰，15 h后逐漸出現(xiàn)修復(fù)反應(yīng)[13]。目前，臨床對(duì)于酸性胃內(nèi)容物吸入性肺損傷的治療僅限于對(duì)癥及支持治療，如氣管插管或氣管鏡下清除吸入物質(zhì)、機(jī)械通氣、抗生素治療、糖皮質(zhì)激素抗炎治療等。然而，這些治療方法均未能取得令人滿意的效果。因此，尋找有效控制吸入性肺損傷的治療方法成為了該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

近年研究[14]表明，15d-PGJ2是組織炎癥及氧化應(yīng)激損傷時(shí)釋放的內(nèi)源性物質(zhì)，對(duì)機(jī)體的炎癥及氧化應(yīng)激損傷起著重要的抑制作用。15d-PGJ2由前列腺素D2(prost aglandin D2, PGD2)自發(fā)脫水形成，是PPAR-γ的天然配體及強(qiáng)激動(dòng)劑之一。Genovese等[6]在博來霉素誘導(dǎo)肺損傷小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，給予PPAR-γ的兩個(gè)激動(dòng)劑，即羅格列酮和15d-PGJ2，能夠減輕肺水腫，減輕炎癥細(xì)胞浸潤和肺部炎癥程度，降低小鼠死亡率。Wang等[7]研究表明，在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中，PPAR-γ激活后能通過抑制高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)-晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation endproducts,RAGE)水平發(fā)揮肺保護(hù)作用。因此，本研究在大鼠發(fā)生酸性胃內(nèi)容物吸入性肺損傷后，給予外源性15d-PGJ2，觀察其能否發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化應(yīng)激的作用，從而產(chǎn)生肺保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，大鼠發(fā)生吸入性肺損傷后，與對(duì)照組比較，治療組損傷后4 h和12 h肺組織炎癥評(píng)分、BALF中的白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)均下降(P<0.05)，提示15d-PGJ2能減輕吸入性肺損傷大鼠肺部炎癥；治療組BALF中總蛋白減少、W/D比值下降(P<0.05)，提示給予15d-PGJ2治療能減少急性肺損傷過程中肺泡內(nèi)富含蛋白液體的滲出，進(jìn)而保護(hù)肺功能。Lu 等[5]的研究也發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)毒素誘發(fā)的急性肺損傷大鼠模型中，通過靜脈注射15d-PGJ2能減輕肺部炎癥和蛋白滲漏。 Zingarelli等[15]發(fā)現(xiàn)，15d-PGJ2能改善膿毒血癥大鼠的血流動(dòng)力學(xué)，降低其血漿TNF-α等細(xì)胞因子的濃度，減輕肺組織中性粒細(xì)胞浸潤，并抑制肺組織中NF-κB和AP-1的活性。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，15d-PGJ2能降低BALF和血清中TNF-α的濃度，且能改善PaO2(P<0.05)，糾正急性肺損傷所誘發(fā)的低氧血癥。

綜上所述，在酸性胃內(nèi)容物吸入性肺損傷大鼠模型中，腹腔注射15d-PGJ2能減輕其肺部損傷和肺部炎癥水平，改善PaO2。本研究的局限性在于：(1)未設(shè)置吸入0.9%氯化鈉液的正常對(duì)照組，因此不利于評(píng)估15d-PGJ2是否對(duì)其他吸入性肺損傷發(fā)揮作用；(2)觀察時(shí)間較短，難以明確15d-PGJ2治療對(duì)大鼠預(yù)后的影響；(3)沒有闡明15d-PGJ2通過PPAR-γ調(diào)控肺臟炎癥的具體分子機(jī)制。今后將補(bǔ)充上述實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證15d-PGJ2對(duì)肺損傷的保護(hù)作用。隨著對(duì)急性肺損傷發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，15d-PGJ2有望取代糖皮質(zhì)激素成為吸入性肺損傷的有效治療藥物。