小檗堿通過Toll樣受體減輕高脂誘導(dǎo)的大鼠腎損害

吳躍躍， 黃新梅， 陳灶萍， 徐 炯， 盛 勵(lì)， 劉 軍

復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，上海 200240

糖尿病已經(jīng)成為我國慢性腎病首要誘因[1]，給我國慢病防治提出了巨大挑戰(zhàn)。以往研究[2-3]報(bào)道，Toll樣受體(TLR)與腎損害相關(guān)。本課題組前期研究[4]顯示，小檗堿能通過改善胰島素抵抗及增加脂聯(lián)素水平來減輕高脂喂養(yǎng)大鼠的腎損害。然而，小檗堿的腎臟保護(hù)作用與TLR的關(guān)系目前鮮見報(bào)道。因此，本研究用小檗堿干預(yù)高脂喂養(yǎng)大鼠，觀察腎臟損害情況及相關(guān)的分子代謝指標(biāo)的改變，以期探討小檗堿改善高脂誘導(dǎo)腎臟損害與TLR的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物來源及分組 50只8周齡清潔級雄性Wistar大鼠購自中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。大鼠體質(zhì)量(220±20)g，自由進(jìn)食、進(jìn)水，環(huán)境溫度為(25±1)℃，晝夜周期為12/12 h。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為：正常喂養(yǎng)組(NF組)、正常喂養(yǎng)小檗堿組(NF+LBBR組)、高脂喂養(yǎng)安慰劑組(HF組)、高脂喂養(yǎng)低劑量小檗堿組(HF+LBBR組)和高脂喂養(yǎng)高劑量小檗堿組(HF+HBBR組)，每組各30只。該研究通過復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部動物福利和倫理小組審查(20160878A019)。

1.2 喂養(yǎng)方法 正常喂養(yǎng)組給予正常標(biāo)準(zhǔn)飼料，高脂喂養(yǎng)組給予高脂飼料(脂肪供能45%)；飼料均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司飼料部提供。每天記錄體質(zhì)量和進(jìn)食量，共喂養(yǎng)8周。喂養(yǎng)4周后， NF+LBBR組、HF+LBBR組及HF+HBBR組分別予低濃度小檗堿(150 mg·kg-1·d-1)、低濃度小檗堿(150 mg·kg-1·d-1)及高濃度小檗堿(380 mg·kg-1·d-1)灌胃4周；小檗堿以0.5%羧甲基纖維素鈉[生工生物工程(上海)股份有限公司]配至所須濃度。HF組予0.5%羧甲基纖維素鈉干預(yù)4周。

1.3 生化指標(biāo)的測定 喂養(yǎng)8周時(shí)，在代謝籠中收集大鼠尿液，測定尿微量白蛋白(MAU)及肌酐(Cr)。尿MAU及Cr測定采用相應(yīng)大鼠ELISA試劑盒(美國GTX公司)，計(jì)算兩者比值(ACR)。

干預(yù)結(jié)束時(shí)，麻醉解剖，主動脈采血，取腎臟組織?？崭寡?GLU)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)等指標(biāo)在全自動生化分析儀 (Hitachi Boehringer Mannheim, 德國)上測定。空腹血清胰島素(FINS)ELISA試劑盒購自美國Crystal Chem公司。血清游離脂肪酸(FFA)采用的非酯化脂肪酸C檢驗(yàn)法試劑盒購自日本W(wǎng)ako Pure Chemical公司。大鼠白細(xì)胞介素-1(IL-1)ELISA試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。大鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)采用的ELISA試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司。

1.4 組織病理檢查 腎臟組織取材后置于甲醛中固定48 h，石蠟包埋，按8 μm厚度切片。Masson染色：腎臟組織切片脫蠟、水化，加入Bouin處理液過夜，用自來水沖洗；分別予蘇木精染色液及堿性品紅染色5～10 min，再予磷鎢酸溶液反應(yīng)5～10 min，最后予苯胺藍(lán)染色。染色后在顯微鏡下(200倍)觀察腎組織病理改變。

1.5 Western印跡測定炎性因子的表達(dá) 腎臟組織勻漿后上樣20 uL，80 V電泳 30 min后再120 V電泳100 min；100 V轉(zhuǎn)膜2 h后，麗春紅染色5～10 min；5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h；加入按推薦的稀釋比配制的TLR2、TLR4、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的相應(yīng)一抗，室溫下孵育2 h；洗膜后，加入按1∶5 000配制的二抗，室溫孵育1 h。ECL顯影曝光后，分析條帶。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠體質(zhì)量變化 結(jié)果(圖1)表明：第3周時(shí)，高脂飲食組大鼠的體質(zhì)量大于正常飲食組(P<0.05)；第5周時(shí)，HF組及HF+LBBR組大鼠的體質(zhì)量明顯大于其余3組(P<0.05)；第6周開始，HF組大鼠的體質(zhì)量大于其余4組(P<0.05)。

圖1 大鼠體質(zhì)量變化m/g

*P<0.05為HF組與NF組相比；△P<0.5為HF+LBBR組與NF組相比；▲P<0.05為HF+HBBR組與NF組相比

2.2 糖脂代謝情況 結(jié)果(表1)表明：HF組大鼠

GLU、FINS、FFA水平較NF組升高(P<0.05)。HF+LBBR組和HF+HBBR組GLU、FINS、FFA較HF組明顯下降(P<0.05)；高脂喂養(yǎng)時(shí)，隨著小檗堿劑量增加，F(xiàn)INS水平進(jìn)一步下降(P<0.05)。

2.3 腎功能變化 結(jié)果(表1)表明：HF組及HF+LBBR組MUC、ACR水平均明顯高于NF組(P<0.05)；HF+HBBR組MUC、ACR水平低于HF+LBBR組(P<0.05)。 各組SCr、BUN水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 Masson染色結(jié)果(圖2)表明：高脂喂養(yǎng)時(shí)，隨著小檗堿劑量增加，腎小球基底膜的厚度變薄，腎小球區(qū)域的藍(lán)色沉淀物減少。

表1 大鼠尿蛋白、糖脂代謝及炎癥因子情況

MAU：尿微量白蛋白；Cr:肌酐； ACR：尿白蛋白/肌酐；SCr：血肌酐；BUN：尿素氮；GLU:空腹血糖；FINS:空腹胰島素；IL-1：白介素-1；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白介素-6.*P<0.05與NF組相比；△P<0.05與HF組相比；▲P<0.05與HF+LBBR組相比

圖2 腎臟組織Masson染色

2.4 炎癥因子變化 結(jié)果(表1)表明：HF組大鼠IL-1、TNF-α、IL-6水平均較NF水平升高(P<0.05)。HF+LBBR組和HF+HBBR組大鼠IL-1、TNF-α、IL-6的水平較HF組明顯降低(P<0.05)。

2.5 ACR影響因素分析 Pearson分析結(jié)果(表2)表明：ACR與GLU、FINS、FFA、IL-1、TNF-α、IL-6正相關(guān)(P<0.05)。以ACR為因變量，GLU、FINS、FFA、IL-1、TNF-α、IL-6為自變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic多元逐步回歸分析，結(jié)果顯示：IL-6與ACR獨(dú)立正相關(guān)[OR=1.18，95%CI 1.03～1.35，P=0.014]。

表2 ACR影響因素的Pearson相關(guān)分析

GLU：空腹血糖；FINS：空腹胰島素；FFA：游離脂肪酸；IL-1：白介素-1；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白介素-6

2.6 腎臟組織TLR4、TLR2、NF-κB、TGF-β的表達(dá)水平 結(jié)果(圖3)顯示：HF組大鼠腎臟組織TLR4、TLR2表達(dá)較NF組減少(P<0.05)；高脂喂養(yǎng)時(shí)，小檗堿干預(yù)后，大鼠腎臟組織TLR4、TLR2表達(dá)增加(P<0.05)。HF組大鼠腎臟組織NF-κB、TGF-β表達(dá)較NF組增加(P<0.05)；高脂喂養(yǎng)時(shí)，小檗堿干預(yù)后，NF-κB、TGF-β表達(dá)減少(P<0.05)。

圖3 高脂喂養(yǎng)與小檗堿對大鼠腎臟組織TLR2、TLR4、NF-κB、TGF-β的表達(dá)的影響

3 討 論

腎臟脂毒性與糖尿病腎病密切相關(guān)。糖尿病患者及糖尿病動物模型的腎臟脂質(zhì)合成代謝增加、脂質(zhì)分解代謝抑制，導(dǎo)致脂質(zhì)堆積，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)，損傷腎臟細(xì)胞[5-7]。研究腎臟脂毒性對于糖尿病腎病的早期防治具有重要意義。研究[8]提示，肥胖相關(guān)腎損害除腎小球肥大外，還有腎小球基膜增厚、系膜基質(zhì)增多及腎內(nèi)炎癥因子增多。這些病理改變導(dǎo)致腎小球硬化及腎小管基質(zhì)硬化，進(jìn)而導(dǎo)致終末期腎病[4]。本研究采用高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠腎臟脂毒性，發(fā)現(xiàn)HF組大鼠體質(zhì)量、FFA水平明顯升高，MAU、ACR升高，同時(shí)造成腎臟損害；小檗堿使上述改變明顯改善。

小檗堿是從黃連或黃柏皮中提煉出來的一種異喹啉生物堿，臨床上主要用于治療腹瀉。近年來的研究[9]發(fā)現(xiàn)，小檗堿具有降糖、改善胰島素敏感性、降血脂、減小體質(zhì)量、減輕炎癥、抗氧化應(yīng)激的作用。本研究得出相似結(jié)論，提示小檗堿有望成為治療腎病的藥物。目前認(rèn)為，小檗堿對糖尿病腎病患者的腎功能有保護(hù)作用，主要分子機(jī)制如下：(1)小檗堿通過AMPK途徑、EP4-Gαs-cAMP信號通路等[10-11]減輕炎癥反應(yīng)及抗氧化應(yīng)激，進(jìn)而保護(hù)腎功能；(2)小檗堿通過調(diào)控β-抑制素、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)/血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及組織抑制因子(TIMPs)等[12-13]保護(hù)腎功能。本課題組前期研究[4,14]顯示，小檗堿通過AMPK途徑改善胰島素抵抗及提高脂聯(lián)素水平，進(jìn)而減輕高脂喂養(yǎng)大鼠的腎損害。本研究顯示，小檗堿可以降低高脂喂養(yǎng)大鼠的IL-1、TNF-α、IL-6的水平；Pearson相關(guān)分析顯示，ACR與GLU、IL-1、TNF-α、IL-6正相關(guān)；進(jìn)一步logistic多因素回歸分析顯示，IL-6與ACR獨(dú)立相關(guān)。上述研究提示，小檗堿減輕高脂喂養(yǎng)大鼠腎臟損傷可能與其改善腎臟炎癥狀態(tài)有關(guān)。

在腎臟缺血灌注損傷中，TLR4/NF-κB通路起主要作用，通過激活TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等炎癥因子，損害腎臟細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡[2]。炎癥和纖維化是糖尿病腎病的主要特征。研究[3]顯示，TLR2通過TGF-β促進(jìn)糖尿病腎病炎癥和纖維化的發(fā)生及發(fā)展。本研究顯示，高脂喂養(yǎng)可以減少大鼠腎臟組織TLR4、TLR2的表達(dá)，增加NF-κB、TGF-β的表達(dá)，而小檗堿可以逆轉(zhuǎn)這一趨勢。本研究中高脂喂養(yǎng)減少TLR的結(jié)果與以往文獻(xiàn)[2]相悖，原因可能與腎臟損害狀態(tài)不同有關(guān)：本研究中高脂誘導(dǎo)腎毒性，引起腎臟慢性炎癥反應(yīng)；而文獻(xiàn)[2]采用缺血再灌注損傷或鏈脲霉素(STZ)誘導(dǎo)腎臟發(fā)生急性炎癥應(yīng)激反應(yīng)。這兩種狀態(tài)對TLR的影響可能不同，但有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究初步顯示，小檗堿能減輕高脂喂養(yǎng)大鼠的腎臟損傷，這可能與小檗堿減輕腎臟炎癥反應(yīng)有關(guān)。小檗堿能促進(jìn)大鼠腎臟組織TLR4、TLR2的表達(dá)，抑制NF-κB及TGF-β的表達(dá)，抑制炎癥因子的釋放及組織纖維化，進(jìn)而改善高脂腎臟損害。