LC-ESI-MS/MS測定白酒中甜味劑三氯蔗糖的方法研究

周 玉，唐艷榮，余 義，劉 莎，毛從興，鄭 靜，孫 琳，劉 艷，時宏偉

(武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢430050)

隨著社會發(fā)展和科技進步,人們越來越重視飲食健康問題,其中三氯蔗糖制作的甜味劑應用范圍較為廣泛。三氯蔗糖的主要原材料是蔗糖,并且在氯代作用下獲取非營養(yǎng)型的強力甜味劑。甜味劑是白色的粉末狀物質(zhì),極易溶于水,水溶液透明,實際甜度能夠達到蔗糖的400～800倍。為此,對于甜味劑三氯蔗糖合成工藝展開進一步的分析具有一定的現(xiàn)實意義[1-3]。甜味劑盡管應用范圍很廣，但是在白酒中是不允許添加的[5]。

白酒是我國的傳統(tǒng)蒸餾酒，按其風味特征可分為各種不同的香型，雖然每種香型各有其典型風格，但是不論哪種香型的白酒，保持適度的甜味，不僅可以遮蓋其他一些苦澀雜味，而且還能使酒體甘洌、醇厚、綿軟，但是這種甜味是來自于自然發(fā)酵產(chǎn)生的，而非添加甜味劑。風味化學研究表明，味覺是由一定的呈味物質(zhì)引起的，酒之所以具有醇甜之感，是因為酒中含有一定量的甜味物質(zhì)，如高級醇、多元醇、氨基酸等，這些甜味物質(zhì)，對于名優(yōu)白酒，是由其特殊的生產(chǎn)工藝決定的，如濃香型大曲酒的低溫入池、緩慢發(fā)酵，就是為了有利于醇甜物質(zhì)的生成，無需另行添加[8]。

人工合成甜味劑可能對人體有致癌、致病的副作用[6]，因而已被許多國家限制使用。尤其在白酒行業(yè)，《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》GB 2760—2014中規(guī)定白酒中甜味劑不得檢出。所以對于白酒中甜味劑的測定應做到嚴格把關(guān)，防止白酒行業(yè)中出現(xiàn)假冒偽劣產(chǎn)品，對消費者產(chǎn)生不利影響。目前，關(guān)于三氯蔗糖的檢測方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]、高效液相色譜法[4-5]、高效液相色譜蒸發(fā)散射法[12]、高效毛細管電泳-間接紫外法[18]、核殼型色譜柱-反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法[19]、紫外衍生-高效液相色譜法[21]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：市售白酒樣品4種。

試劑及耗材：三氯蔗糖（規(guī)格1 g，儲存溫度2～8℃，日本和光純藥工業(yè)株式會社）；甲醇（色譜純，美國Baker公司）；乙酸銨（分析純，天津市天力化學試劑有限公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司，規(guī)格600 mL）。

儀器設備：Agilent 1260LC-Agilent 6460安捷倫三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀(安捷倫科技有限公司）；Agilent ZORBAX RX-C18安捷倫色譜柱（4.6×250 mm，5 μm，安捷倫科技有限公司）；有機濾膜(孔徑0.22 μm，天津津騰)；全玻璃微孔過濾器(規(guī)格1000 mL，天津津騰實驗設備有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

準確稱取10 mg(精確至0.0001 mg)三氯蔗糖標準品于100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至100 mL)，配制成100 mg/L的標準儲備液，置于4℃冰箱中保存。根據(jù)使用需要，用蒸餾水逐級稀釋成適當濃度的混合標準工作液。

1.2.2 樣品前處理方法

用一次性注射器吸取均質(zhì)樣品，經(jīng)0.22 μm的有機濾膜過濾，濾液供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX RX-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A為0.02 mol/L乙酸銨溶液，B為甲醇；流動相體積比A∶B=30∶70；流速：0.4 mL/min；柱溫箱：25 ℃；進樣量：2 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應檢測模式；干燥氣體溫度：325℃；干燥氣體流速：6 L/min；噴霧電壓：206.8 kPa。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采取直接進樣的方式，將目標物標準溶液注入質(zhì)譜，分別進行正離子模式和負離子模式全掃描檢測，得到一級質(zhì)譜圖和準分子離子峰，再用惰性氣體氮氣攻擊該母離子，獲得其二級質(zhì)譜圖及相應的子離子。結(jié)果表明，在負離子模式下響應值及靈敏度均高于正離子模式，因此，本方法選擇負離子電離模式。利用多反應監(jiān)測模式（MRM）對選定的定性離子和定量離子對碎裂電壓、碰撞能、保留時間、碰撞池加速電壓等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，使各監(jiān)測離子豐度和信號達到最佳。負離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

分別以0.1%乙酸-甲醇、0.1%乙酸-乙腈、2 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相進行樣品分離。結(jié)果表明，用2 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相時物質(zhì)分離度、峰形、響應值以及保留時間的穩(wěn)定性均優(yōu)于0.1%乙酸-乙腈、0.1%乙酸-甲醇，故本方法最終選用2 mmol/L乙酸銨-甲醇為流動相進行洗脫。圖1是三氯蔗糖在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下的MRM色譜圖。

表1 三氯蔗糖的質(zhì)譜參數(shù)

圖1 三氯蔗糖的多反應監(jiān)測色譜圖

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

線性范圍、檢出限和定量限參照呂謙、楊小玉、王玉紅等[15-19]的方法，將三氯蔗糖標準儲備液用蒸餾水稀釋，分別配制成濃度為40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、400 μg/L、800 μg/L的5種標準工作液，按1.2節(jié)所述的色譜-質(zhì)譜條件進行測定，繪制標準工作曲線（圖2）。

圖2 三氯蔗糖的線性相關(guān)系數(shù)

結(jié)果顯示，在40～800 μg/L的濃度范圍，所有分析物的質(zhì)量濃度x(ng/mL)和響應值y之間線性相關(guān)系數(shù)為0.99999；以性噪比為3確定檢出限為40 μg/L，以性噪比為10確定定量限為100 μg/L。

2.3 精密度和回收率

精密度和回收率參照韓秋珍、陳璐瑩、劉亞攀等[20-21]的方法，采用在空白樣品中添加標準溶液的方法，選擇常見的濃香型和兼香型兩個不同香型白酒酒樣及乙醇進行三氯蔗糖檢測試驗，成品白酒1、白酒2和乙醇3的三氯蔗糖含量均為未檢出，并向兩個樣品中分別添加濃度為200 μg/L、400 μg/L的三氯蔗糖進行回收率實驗，重復測定2次。共6組平行，12次檢測，結(jié)果表明，在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的相對偏差小于2%，且回收率均在85%～105%范圍內(nèi)，所以該方法的精密度和回收率均符合相關(guān)標準要求。

2.4 與國標法比對

選擇常見的4種不同類型白酒酒樣添加三氯蔗糖，將本方法與國標GB 22255—2014《食品安全國家標準食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》方法進行加標測回收率結(jié)果比對，比對結(jié)果見表2。

將本方法和國標方法的數(shù)據(jù)進行比較，兩組數(shù)據(jù)的絕對偏差小于1，相對偏差小于5%。國標方法中三氯蔗糖的定量限是2.5 mg/L；本方法的檢出限是0.04 mg/L，定量限是0.1 mg/L。結(jié)果表明，本方法可以用于白酒中三氯蔗糖的檢測。相比液相色譜系統(tǒng)，液相質(zhì)譜聯(lián)用儀具有更高的分離度和靈敏度以及更短的檢測時間。

3 結(jié)論

本研究利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了白酒中甜味劑三氯蔗糖化合物的分子信息，利用多反應監(jiān)測模式的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)，建立了一個快速、穩(wěn)定、靈敏的可定性定量檢測三氯蔗糖的方法。該方法可在10 min內(nèi)完成，其檢測范圍內(nèi)線性良好（r=0.99999），檢出限0.04 mg/L，定量限0.1 mg/L，精密度＜2%，回收率＞85%，且與國標中的檢測方法相比檢出限更低，能更加有效的監(jiān)測白酒中三氯蔗糖的含量，綜上所述，該方法可以對三氯蔗糖進行實際的定性定量檢測。

表2 方法結(jié)果比對