無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查在單雙胎中的應(yīng)用研究

彭海山 黃華潔 楊潔霞 侯亞萍 郭芳芳 齊一鳴 羅曉輝 王東梅 王奕霞 尹愛(ài)華

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442)

近年來(lái)，由于人們生育時(shí)間的推遲以及輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，輔助生殖成為受孕困難患者的首要選擇，而促排卵藥物的使用導(dǎo)致越來(lái)越多的雙胎妊娠甚至是多胎妊娠發(fā)生[1-4]。與單胎妊娠相比，雙胎妊娠的染色體非整倍體發(fā)生率更高且篩查工作更為復(fù)雜，集中在雙胎的合子性質(zhì)對(duì)篩查的影響以及雙胎更容易發(fā)生有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的并發(fā)癥等方面[1, 3, 4]。因此，急需一項(xiàng)創(chuàng)傷性小且準(zhǔn)確有效的篩查手段解決雙胎妊娠的產(chǎn)前篩查需求。

無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查因其篩查的高效準(zhǔn)確且創(chuàng)傷性小無(wú)并發(fā)癥等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上受到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用[5]。目前，已有許多文獻(xiàn)報(bào)道無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查在單胎妊娠人群中有著很高的檢出率與準(zhǔn)確性，且許多專家學(xué)者也提出了其方法的可擴(kuò)展性。國(guó)內(nèi)外已有將無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查應(yīng)用于雙胎染色體非整倍體的篩查可能性的研究，但目前數(shù)據(jù)積累較少，仍需進(jìn)一步證據(jù)支持。本文就廣東地區(qū)雙胎與單胎應(yīng)用NIPT進(jìn)行染色體非整倍體篩查進(jìn)行對(duì)比研究，旨在為NIPT的雙胎篩查增加研究數(shù)據(jù)的支持。

1 資料和方法

1.1 研究方案和對(duì)象 選擇2015年1月至2017年7月于本院產(chǎn)檢并自愿接受NIPT的孕婦雙胎妊娠442例，單胎妊娠15 206例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①孕周12周以上；②孕婦體重100kg以下；③夫妻染色體未發(fā)現(xiàn)明顯異常者；④近一年內(nèi)未接受過(guò)異體輸血，細(xì)胞治療，免疫治療及無(wú)移植手術(shù)者。雙胎妊娠孕婦年齡為16～48歲，孕周12～33周。單胎妊娠孕婦年齡為16～50歲，孕周12～38周。所有孕婦均充分告知了NIPT的臨床適應(yīng)證和局限性，并簽署了知情同意書(shū)且本研究通過(guò)廣東省婦幼保健院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 抽取孕婦外周靜脈血8ml置于EDTA抗凝管中，8小時(shí)內(nèi)分離血漿后分裝保存于-80℃冰箱。

1.2.2 NIPT流程及數(shù)據(jù)分析 使用博奧晶芯胎兒染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒提取血漿游離DNA及制備文庫(kù)，使用ION Proton(life technology, America)平臺(tái)高通量測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)處理后通過(guò)Z-score值來(lái)判斷某條染色體是否有拷貝數(shù)的異常，主要判斷標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)Z≥3時(shí)，結(jié)果提示為三體高風(fēng)險(xiǎn)；當(dāng)-3

1.2.3 結(jié)果驗(yàn)證 NIPT結(jié)果提示低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦定期常規(guī)產(chǎn)檢；提示為高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，建議進(jìn)一步行羊水或臍血穿刺，通過(guò)染色體核型分析結(jié)果檢驗(yàn)NIPT結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.4 妊娠結(jié)局隨訪 打電話對(duì)所有孕婦妊娠結(jié)局追蹤隨訪或查閱本院電子病歷，包括孕期超聲篩查結(jié)果、妊娠結(jié)局、新生兒體檢的外貌、結(jié)構(gòu)、智力發(fā)育等。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，計(jì)算NIPT的靈敏度，特異度，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，陰性預(yù)測(cè)值。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 單雙胎妊娠孕婦信息 除去臨床信息不全和失訪病例，共收集單胎孕婦15 206例，雙胎孕婦442例，具體信息見(jiàn)表1。單胎與雙胎在年齡和孕周分布上無(wú)差別，χ2分別為9.655和4.51，P分別為0.086和0.341。高齡所占比例分別為35.14%和38.91%，P=0.101。然而，在單胎妊娠孕婦中，通過(guò)IVF方式獲得胎兒的僅占4.14%，雙胎中將近一半的受孕方式是IVF。且雙胎中大部分是雙合子雙胎。

表1 單雙胎孕婦基本信息

2.2 雙胎妊娠孕婦NIPT結(jié)果及核型結(jié)果 442例自愿進(jìn)行NIPT的雙胎妊娠孕婦中，共檢出高風(fēng)險(xiǎn)3例。3例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦均選擇進(jìn)一步有創(chuàng)產(chǎn)前診斷，經(jīng)染色體核型分析，其中1例21-三體高風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果確診為47，XN,+21；2例18-三體高風(fēng)險(xiǎn)，一例確診為47，XN，+18，后行選擇性減胎術(shù)，另一例結(jié)果為46，XN，選擇繼續(xù)妊娠。具體情況見(jiàn)表2。

表2 雙胎妊娠無(wú)創(chuàng)檢測(cè)異常與產(chǎn)前診斷結(jié)果比較

2.3 NIPT對(duì)單雙胎妊娠篩查效能比較 15 206例單胎妊娠孕婦中，NIPT高風(fēng)險(xiǎn)選擇進(jìn)一步行產(chǎn)前診斷者共81例，其中經(jīng)染色體核型分析確診共65例。雙胎3例高風(fēng)險(xiǎn)中確診2例。在對(duì)單胎妊娠低風(fēng)險(xiǎn)孕婦的隨訪中，發(fā)現(xiàn)1例18-三體假陰性病例，后經(jīng)染色體核型確定為18-三體嵌合。雙胎妊娠低風(fēng)險(xiǎn)孕婦隨訪未發(fā)現(xiàn)異常。比較NIPT在單胎和雙胎中的篩查效能，具體情況見(jiàn)表3。

表3 單雙胎NIPT檢測(cè)效能比較

3 討論

染色體非整倍體是缺陷兒出生的主要原因，21、18、13及性染色體三體綜合征是最常見(jiàn)的染色體非整倍體[2]。雖然我國(guó)從2001年開(kāi)始實(shí)施出生缺陷干預(yù)工程，但出生缺陷率仍高達(dá)5.6%，出生缺陷人數(shù)每年新增約90萬(wàn)人。大多出生缺陷無(wú)有效治療手段，通過(guò)產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷進(jìn)行出生缺陷的預(yù)防和干預(yù)是降低出生缺陷率最有效的手段[6]。由于受生活方式改變和環(huán)境等多因素影響，不孕癥患者逐漸增多，輔助生殖技術(shù)幫助了許多不孕癥患者的同時(shí)也使得雙胎和多胎妊娠發(fā)生率明顯增加。本研究顯示雙胎中接受輔助生殖技術(shù)的比例明顯高于單胎妊娠，大約51.58%左右的雙胎是通過(guò)IVF方式受孕，而單胎妊娠中IVF的比例只占到了4.14%(表1)。自然狀態(tài)下，雙胎發(fā)生率約1/90，而目前我國(guó)雙胎妊娠發(fā)生率可達(dá)2%[7]。有研究表明，相對(duì)于單胎，雙胎妊娠胎兒異常的發(fā)生率更高，且雙胎的染色體非整倍體產(chǎn)前篩查更為復(fù)雜，主要表現(xiàn)在傳統(tǒng)血清學(xué)篩查對(duì)雙胎的檢出率更低，假陽(yáng)性率更高，而雙胎妊娠進(jìn)行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷時(shí)更容易導(dǎo)致流產(chǎn)早產(chǎn)，需要承擔(dān)更大的風(fēng)險(xiǎn)[2, 8, 9]。因此，對(duì)于雙胎妊娠，迫切需要一項(xiàng)安全且有效的篩查方式。

隨著胎兒游離DNA理論的提出和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)性的產(chǎn)前篩查成為可能。同時(shí)，由于該項(xiàng)技術(shù)無(wú)創(chuàng)、安全、高效，很快得到了廣泛的應(yīng)用，已有許多數(shù)據(jù)表明在單胎妊娠孕婦中，NIPT有著優(yōu)秀的檢測(cè)效果，但雙胎數(shù)據(jù)較少[9]。雖然有證據(jù)表明NIPT在雙胎篩查中對(duì)21-三體的篩查效能較高，有潛在的應(yīng)用價(jià)值[10, 11]，但仍需要進(jìn)一步的數(shù)據(jù)積累證明，目前指南中雙胎仍是慎用人群。本研究收集了442例行NIPT的雙胎孕婦，共檢測(cè)出1例T21、2例T18。經(jīng)有創(chuàng)產(chǎn)前診斷結(jié)果證實(shí)21-三體全部可被識(shí)別，18-三體有1例被正確識(shí)別，T21、T18的靈敏度均為100%，且該兩例正確識(shí)別孕婦的胎兒情況均為一胎染色體異常，另一胎正常。本研究中T21的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可達(dá)100%，T18陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為50%，由于未檢出13-三體，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值不可得。對(duì)比于單胎21、18、13的檢測(cè)結(jié)果，T21陽(yáng)性預(yù)測(cè)值89.66%，T18陽(yáng)性預(yù)測(cè)值75%，T13陽(yáng)性預(yù)測(cè)值36.36%，雙胎的檢測(cè)效能與單胎類似，對(duì)21-三體的篩查效果比18-三體高，說(shuō)明NIPT在雙胎染色體非整倍體篩查中有一定的應(yīng)用價(jià)值。

雖然NIPT在雙胎妊娠中有一定的應(yīng)用價(jià)值，但是不可否認(rèn)，相對(duì)于單胎而言，NIPT應(yīng)用于雙胎需要更慎重。鑒于NIPT的檢測(cè)原理，其結(jié)果的準(zhǔn)確性與胎兒游離DNA的濃度即胎兒分?jǐn)?shù)是密切相關(guān)的。未對(duì)胎兒濃度進(jìn)行討論是本研究的不足之處。對(duì)于單胎，檢測(cè)要求胎兒游離DNA達(dá)到4%以上才符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，否則可能檢測(cè)不到胎兒染色體異常，造成假陰性。而雙胎由于合子性質(zhì)的影響，更為復(fù)雜。單合子雙胎由于由一個(gè)受精卵分裂而來(lái)，絕大部分的單合子雙胎所含的遺傳物質(zhì)相同，可等同于單胎。雙合子雙胎則有著不同的遺傳物質(zhì)，是兩個(gè)獨(dú)立的胎兒，且有研究表明，在兩個(gè)遺傳物質(zhì)不同的雙胎中，兩個(gè)雙胎對(duì)胎兒游離DNA的貢獻(xiàn)量是不同的，甚至可以達(dá)到2倍的差異[12]。在雙合子雙胎中，常常存在一胎正常而另一胎異常的情況，通常正常胎兒貢獻(xiàn)的游離DNA量比異常胎兒的高，這樣就容易造成即使總體胎兒濃度分?jǐn)?shù)達(dá)到檢測(cè)要求也可能由于異常胎兒游離DNA量不足導(dǎo)致假陰性的發(fā)生。為了防止此情況的發(fā)生，有部分研究采用了釋放較少DNA的一胎的胎兒濃度分?jǐn)?shù)進(jìn)行結(jié)果判讀分析，但此方法由于胎兒濃度變低，可導(dǎo)致檢測(cè)失敗率增加[13]。因此，NIPT在雙胎妊娠中應(yīng)用如何增加檢測(cè)成功率的同時(shí)又能夠最大程度避免假陰性結(jié)果的可能是將來(lái)研究的方向。

4 結(jié)論

研究表明NIPT用于雙胎妊娠的染色體非整倍體篩查有一定的應(yīng)用價(jià)值，其對(duì)21-三體的篩查效率高于18-三體。由于13-三體無(wú)陽(yáng)性例數(shù)的緣故，對(duì)其的篩查效率未做評(píng)價(jià)。該結(jié)論需要大數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持證實(shí)。