雞新城疫診斷抗原制備方法的研究

詹麗娥　陸冰洋　劉華棟　李婷婷　唐娟　王彩先　丁樹榮

摘要：將疑似新城疫病料無菌采集后進行RT-PCR鑒定，將陽性病料研磨后接種SPF雞胚，收獲的陽性尿囊液進行血凝試驗（HA）及血凝抑制試驗（H1）檢測病毒效價，病毒效價達到2⁷～2⁸，病毒凝集效價達到10log2。使用10%蔗糖溶液及18-25kDa透析袋對陽性尿囊液進行濃縮，濃縮至原體積的1/5；10%福爾馬林滅活診斷抗原，經(jīng)過6h后滅活達100%；診斷抗原效價測定：血凝效價為2¹⁰；血凝抑制效價為10log2。利用制備的雞新城疫診斷抗原和雞新城疫標準診斷抗原與雞新城疫標準檢測抗體進行血凝試驗（HA）與血凝抑制試驗（HI），對比結果：雞新城疫診斷抗原病毒效價為2¹⁰，高于雞新城疫標準診斷抗原的2。，雞新城疫診斷抗原凝集效價為10log2，等同于雞新城疫標準診斷抗原，證明所制備雞新城疫診斷抗原符合要求，可以應用到生產實踐中。

關鍵詞：新城疫，RT-PCR，抗原檢測，抗原制備，抗體檢測

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。病雞是本病的主要傳染源，感染后臨床癥狀主要表現(xiàn)為：呼吸困難，拉綠色稀便，精神沉郁，個別出現(xiàn)轉圈的神經(jīng)癥狀。病毒存在于病雞所有組織器官、體液、分泌物和排泄物中。在流行間歇期的帶毒雞也是本病的傳染源，病毒可經(jīng)消化道、呼吸道、眼結膜、受傷的皮膚和泄殖腔黏膜侵入機體。該病一年四季均可發(fā)生，以春秋季較多，雞群一旦發(fā)生本病可于4-5d內波及全群，具有極高的發(fā)病率和病死率，是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為A類疫病，我國列入重大傳染病，也是禽類重點防控的傳染病之一。

目前對雞城新城的主要防控措施有以下幾種：1）新城疫疫苗預防，我國已將新城疫的免疫列入各養(yǎng)雞場的免疫程序；2）采取分子生物學方法和免疫學方法進行流行病學調查，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，將易感雞提前撲殺，控制易感雞群感染?？梢钥焖?、簡便診斷新城疫，易于基層獸醫(yī)站工作人員和雞場化驗員掌握，血凝試驗和血凝抑制試驗均需要新城疫診斷抗原，本項目對新城疫診斷抗原的制備方法進行研究，采用血清學方法對雞群進行流行病學調查，達到了早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療控制NDV傳播與流行的目的。

1.材料和方法

1.1病料

新城疫病料組織無菌采自山西太原、晉中、呂梁等地疑似發(fā)病雞場。

1.2主要試劑及材料

新城疫標準陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；新城疫標準陽性抗原購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司新城疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；dNTP（2.5mmol/Leach）、AMV、RNaseInhibitor、6^*Ioadinq Buffer、RT-PCRKit購自寶生物工程（大連）有限公司；Trizol購自Invitrogen公司引物由華大基因公司合成；即用型透析袋18-25kDa RC膜S/P購自美國光譜醫(yī)學；其他試劑均為國產分析純試劑；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.3主要儀器

4℃冷凍離心機（型號為Neofuge 13R），購自HealForce公司；分光光度計（型號為BioPhotometer），購自Eppendorf公司；電熱恒溫水浴鍋（型號為HHS型），購自天津市華北實驗儀器有限公司；BIOER基因擴增儀（型號為G1000），購自杭州博日科技有限公司；電泳儀（型號為GEI00），購自MiniRun公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號為Imageouant300），購自GE Healthcare公司；超凈臺，購自北京半導體一廠。

1.4引物設計與合成

參考新城疫診斷技術GB/T16550-2008中RT-PCR通用引物，引物序列（表1）：

1.5病料的處理

將采集到的16份疑似新城疫病料按OIE手冊中診斷與疫苗標準部分關于新城疫病毒處理的標準方法進行，具體方法為：將凍存的病料融化后剪碎，放入研磨器中，加入滅菌PBS研磨并加入青鏈霉素終濃度為1mg/mL，得到的懸濁液加入等體積氯仿，充分震蕩后置于4℃過夜，12，000rpm離心15min將上清移入滅菌的EP管中備用。

1.6疑似病料RNA的提取及RT-PCR檢測

分別取1.4處理后的上清液100μL于EP管內，加入裂解液600μL，充分顛倒混勻，室溫靜置3～5min；將液體吸入吸附柱中，13，000rpm離心30s；棄去收集管中液體，加入600μL洗液，13，000rpm離心30s，重復該步驟一次；棄去收集管中液體，13，000rpm空柱離心2min；將吸附柱移入新的1.5mL離心管中，向柱中央加入洗脫液50μL，室溫靜置1min，13，000rpm離心30s，離心管中液體即為模板RNA。

RT-PCR總體積為20μL，加入16.8μL RT-PCR反應液，1.2μL酶混合液，加提取的RNA2μL。反應條件：42℃45min，94℃3min；循環(huán)94℃30s，55℃30s，72℃30s，共35次；再72℃延伸7min。

1.7SPF雞胚培養(yǎng)

將1.4中處理后的陽性病料上清液100μL超凈臺無菌接種于9日齡SPF雞胚尿囊腔，37℃培養(yǎng)24h后將死亡SPF雞胚取出，72h后無菌取尿囊液，連傳三代。

1.8陽性病料PCR檢測

參照RNA常規(guī)提取方法，取1.7中陽性病毒樣品250μL，加Trizol 750μL，劇烈振蕩15s，靜置5min；加500μL氯仿，混勻，靜置5min，4℃、12，000r/min離心15min；取上清液加等體積異丙醇，混勻，液氮沉降20min，取出室溫融化后，4℃、12，000r/min離心20min；棄上清液，加-20℃75%乙醇1mL，靜置15s，倒掉，重復一次；超凈臺風干后，加20μL DEPC水溶解RNA，分光光度計檢測RNA含量，-80℃保存，備用。

RT-PCR反應體系（表2）。

反應條件：反轉錄42℃45min；預變性95℃3a‘iR；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30個循環(huán)；終延伸72℃10min。產物進行電泳。

1.9病毒效價檢測與凝集價檢測

通過血凝試驗（HA）檢測新城疫病毒效價：取96孔板，每孔加50μL PBS；第——孔加50μL陽性尿囊液混勻，抽取第一孔50μL混合液加入第二孔，依次將陽性尿囊液進行2^-1～2^-12稀釋，第十二孔混勻后棄去50μL；然后在每孔加入50μL 1%雞紅細胞，震蕩器震蕩1min混勻，放入37℃恒溫箱20min進行反應。

通過血凝抑制試驗（H1）檢測新城疫病毒凝集價：根據(jù)1.9血凝試驗結果，將新城疫陽性尿囊液按照血凝滴度配制成4個血凝單位抗原；取96孔板，在第1～11孔加入0.025μL PBS，第12孔加入0.05μL PBS；在第1孔加入0.025μL標準陽性血清混勻，然后從第1孔吸出0.025μL液體加入第2孔，依次加至第10孔，第11孔為陽性對照，第12孔為陰性PBS對照；在第1～11孔加入0.025μL 4HAU抗原；每孔加入0.025μL 1%雞血細胞懸液，震蕩混勻，放37℃恒溫箱20min后，當PBS對照孔紅細胞呈明顯紐扣狀沉到孔底時判定結果。

1.10陽性診斷抗原濃縮與滅活

取SPF雞胚繁殖病毒陽性尿囊液50mL加入透吸袋里，透吸袋兩頭用醫(yī)用止血鉗挾住，將500mL10%的蔗糖溶液倒入搪瓷盤里鋪開，放入裝有50mL病毒尿囊液的透吸袋，根據(jù)滲透壓差的方向，10%的蔗糖溶液將水分從50mL病毒尿囊液透析袋里析出，當透析袋里的陽性病毒尿囊液體積達到10-15mL即可停止?jié)饪s；用移液槍將透析袋里的陽性病毒尿囊液吸入無菌瓶里，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

濃縮的陽性病毒尿囊液用10%福爾馬林滅活，100mL陽性病毒尿囊液中加入0.2mL福爾馬林搖勻，1h后放入20℃?zhèn)溆谩Ｈ缁詈蟮年栃圆《灸蚰乙航臃N9日齡SPF雞胚，72h后收尿囊液進行RNA提取并進行RT-PCR，方法如1.8。

1.11濃縮陽性診斷抗原效價測定

參考新城疫診斷技術GB/T16550-2008中血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（H1）方法，使用標準陽性血清檢測濃縮陽性診斷抗原效價，并與新城疫標準診斷抗原進行對比。

2結果與分析

2.1疑似病料RNA的提取及RT-PCR檢測

16份疑似病料中經(jīng)過RNA提取和RT-PCR反應，取PCR產物5μL+6×loading Buffer 2μL，加樣于1%瓊脂糖凝膠中。電泳條件：電壓100V，時間20min。

檢測疑似新城疫病料共計16份（結果如圖1），檢出4份，陽性率為25%。

2.2SPF雞胚培養(yǎng)

4份陽性病料，每份第一代接種5枚，第二代接種5枚，第三代接種30枚。接種情況（如表3）：

2.3陽性病料PCR檢測

對所得4份陽性病料進行RT-PCR檢驗，均為陽性（如圖2）。

2.4病毒效價檢測與凝集價檢測

陽性病料尿囊液通過血凝試驗（HA）分別達到2⁸、2⁷、2⁷、2⁸，符合預期。

陽性病料尿囊液所制備的4個血凝單位抗原與標準陽性抗體進行血凝抑制試驗（H1），效價結果分別為：10log2、10log2、10log2、10log2，陽性對照與PBS陰性對照無自凝，結果符合預期。

2.5陽性診斷抗原濃縮與滅活

含有50mL陽性病料尿囊液的18-25kDa透析袋放入10%蔗糖溶液經(jīng)過6h透析，每2h換液一次，濃縮為10mL。

滅活后的陽性診斷抗原經(jīng)過3代SPF雞胚傳代后，尿囊液進行RT-PCR，結果如圖3。

4份陽性診斷抗原均為陰性，說明福爾馬林滅活陽性尿囊液達到滅活效果。

2.6濃縮陽性診斷抗原效價測定

濃縮陽性診斷抗原通過血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（H1）檢測，結果如（表4）

濃縮陽性診斷抗原血凝試驗（HA）檢測結果分別為210、210、210和210，符合預期；血凝抑制試驗（H1）檢測結果分別為10log2、10log2、10log2和10log2，符合預期。新城疫陽性診斷標準抗原血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（H1）結果分別為2。和10log2，表明濃縮陽性診斷抗原與新城疫陽性診斷抗原具有穩(wěn)定良好的一致性。

3討論

本研究通過RT-PCR從本地疑似病料中鑒別出陽性病料，利用SPF雞胚將陽性病料純化后進行RT-PCR檢測；將純化后的陽性尿囊液濃縮滅活制備成診斷抗原，并與雞新城疫標準陽性診斷抗原與雞新城疫標準陽性檢測抗體進行血凝試驗（HA）和血凝抑制試驗（H1）的對比，檢驗自制診斷抗原水平是否達到預期結果。在生產實踐中可以使用自制診斷抗原，快速對不同雞群進行雞新城疫流行病學調查和免疫抗體的檢測，達到早發(fā)現(xiàn)、快速診斷、早治療的目的，減少雞場的經(jīng)濟損失。推廣后可以對我省禽傳染病的流行情況和發(fā)病情況做出更為準確的判斷，為禽傳染病的防治提供基礎。

雞傳染性法氏囊病流行特點

1法氏囊病傳染性強、傳播速度快，雞群一旦發(fā)病，很快波及全群或全場；若沒有繼發(fā)感染，死亡率相對較低、幾乎沒有明顯的死亡高峰現(xiàn)象。

2近幾年無明顯的季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生。

3法氏囊病是高度直接接觸性傳染病，且病毒有高度的耐受性，能長期存在于雞舍的環(huán)境中，不易清除。