環(huán)境因子對(duì)白木香結(jié)香質(zhì)量的影響

馬惠芬，鄭科，王衛(wèi)斌,肖支葉，華梅，谷麗萍

(1.云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家林業(yè)和草原局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201；3.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224)

白木香[Aquilariasinensis(Lour.) Spreng.]又名土沉香，常綠喬木，小枝具軟毛，芽具長(zhǎng)柔毛。葉質(zhì)硬，單葉互生，葉片有卵形、倒卵形或者長(zhǎng)圓形，長(zhǎng)5-10cm，寬2-4cm，葉片前緣逐漸變尖，葉緣光滑。表面有淺灰色軟毛的傘形花序，花梗長(zhǎng)4-12cm，花被黃綠色，鐘狀，5裂，具有軟毛，喉部有細(xì)密軟毛10片，雄蕊10個(gè)，子房卵形。蒴果，木質(zhì)化，扁平倒卵形，長(zhǎng)2.5-3cm，果實(shí)表面有濃密的淺灰色軟毛，在果實(shí)基部附著花被，種子卵形，其底部有長(zhǎng)尾狀的東西附著，比種子約長(zhǎng)2倍。開花日期在3-5月，結(jié)果日期在6-7月[1]。

在我國(guó)白木香植物資源非常豐富，歷史上有記載道“交干連枝，崗嶺相接，千里不絕”，而且國(guó)產(chǎn)沉香的品質(zhì)優(yōu)良[2-3]。但是由于沉香源植物自然繁殖率低、病蟲害和生存環(huán)境破壞致其瀕危，且自古以來人們對(duì)野生大樹掠奪、采伐使其種群更新難以順利進(jìn)行。目前已經(jīng)被列為國(guó)家珍稀瀕危三級(jí)保護(hù)植物、國(guó)家二級(jí)野生重點(diǎn)保護(hù)植物，2003年被載入《廣東省珍稀顏危植物》[4-6]。其野生及栽培植物資源均分布在北回歸線附近以南，年平均氣溫24-30℃，1月平均氣溫13-20℃，1月最低氣溫8℃，7月平均氣溫26-30℃，7月最高溫35℃，年平均降水量1 200-1 500mm，年均日照時(shí)數(shù)1 562-2 145h，年相對(duì)濕度77.9%-83.7%。適宜土壤為磚紅壤、赤紅壤、紅壤、黃壤等。在我國(guó)野生的白木香資源主要分布在廣東、海南、廣西、福建、云南、澳門、香港等地，其中廣東省、海南省最豐富，是這兩地的道地藥材。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，栽培白木香的種群主要分布于福建省的福州市、詔安縣、廈門市，廣東電白、汕頭、東堯、中山，廣西的桂林市、南寧市，云南省的景洪市等地，種植規(guī)模不斷擴(kuò)大[7-8]。

很多的白木香種植10多年都沒有結(jié)香，這是由于在正常情況下，健康白木香并不能產(chǎn)香，因白木香結(jié)香必須受到各種物理或化學(xué)及真菌侵染后才能產(chǎn)生[9],但沉香形成過程及其機(jī)制至今尚未闡明。對(duì)于目前國(guó)內(nèi)外產(chǎn)香機(jī)理方面的研究，主要集中在以下4點(diǎn)：病理學(xué)、創(chuàng)傷病理學(xué)、非病理學(xué)及防御反應(yīng)假說。蔣謙才等的研究表明白木香的不同葉型、不同胸徑、鉆孔的高度與通體結(jié)香質(zhì)量差異有一定相關(guān)性[10]，高曉霞等認(rèn)為白木香葉中角鯊烯、生育酚及9，12，15-十八烷三烯酸甲酯可作為判斷白木香是否結(jié)香的分子標(biāo)記[11]，趙桐等推測(cè)白木香氣生根在MeJA處理后，PCD的發(fā)生可能與2-(2-苯乙基)色酮的產(chǎn)生存在正相關(guān)性[12]，董雷等發(fā)現(xiàn)沉香(樹脂)形成對(duì)白木香果皮揮發(fā)性成分可產(chǎn)生一定影響,但未結(jié)香、已結(jié)香其果皮揮發(fā)性成分的組成未呈顯著性差異[13]。沉香是白木香受傷害后次生代謝的產(chǎn)物，而次生代謝的調(diào)節(jié)和變化是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，同時(shí)受到一系列環(huán)境因子的共同影響，揭示環(huán)境因素對(duì)次生代謝的影響是認(rèn)識(shí)植物次生代謝有效成分變化以及植物種植時(shí)有效成分控制的理論基礎(chǔ)。探索闡明植物次生代謝產(chǎn)物與環(huán)境的關(guān)系，既有利于提高資源植物生物工程的效率和質(zhì)量，也有助于資源植物的標(biāo)準(zhǔn)化和目標(biāo)化種植[14]。戴佳麗等的研究證實(shí)小地形對(duì)貴州苦丁茶(Cratoxylumformosum)的產(chǎn)量、生理特性及品質(zhì)的都有顯著影響[15],而目前尚未見環(huán)境因子對(duì)白木香結(jié)香質(zhì)量影響的相關(guān)研究報(bào)道。本文通過調(diào)查、取樣、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，以期探討環(huán)境因子對(duì)白木香結(jié)香質(zhì)量的影響，為探討環(huán)境因子與白木香結(jié)香質(zhì)量相關(guān)性的研究提供思路和參考。

1 材料與方法

1.1 野外調(diào)查和取樣

調(diào)查取樣地點(diǎn)設(shè)在云南省西雙版納傣族自治州勐海縣東部偏北勐宋鄉(xiāng)廣順白木香種植基地，地處100°24′48″-100°40′25″E，21°56′54″-22°16′59″N之間。該基地所種植的白木香樹齡在10年以上，選取2013年做過結(jié)香實(shí)驗(yàn)，有結(jié)香跡象的白木香樹為調(diào)查、取樣對(duì)象，記錄該植株所在位置的海拔，坡向、坡度以及周圍環(huán)境，取植株疑似結(jié)香部分和周圍土壤樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。

1.2 土壤樣品

pH測(cè)定值采用電位法︱NY/T 1377-2007，所用儀器pH計(jì)/PHS-3C；有機(jī)質(zhì)測(cè)定采用油浴加熱重鉻酸鉀氧化·容量法︱NY/T 1121.6-2006，所用儀器25mL酸式滴定管/天波；水解性氮測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法︱LY/T 1228-2015，所用儀器5mL微量滴定管/天波；有效磷測(cè)定采用0.50mol/L 碳酸氫鈉浸提·鉬銻抗比色法︱NY/T 149-1990，所用儀器紫外-可見光分光光度計(jì)/752自動(dòng)；速效鉀和交換性鈣、鎂測(cè)定采用1mol/L乙酸銨浸提·原子吸收分光光度法︱NY/T 889-2004，有效鋅、錳、銅、鐵測(cè)定采用二乙三胺五乙酸(DTPA)浸提法︱NY/T 890-2004，所用儀器均為原子吸收分光光度計(jì)/990F。

1.3 揮發(fā)性化學(xué)成分的提取

將所取白木香樣品粉碎，過40目篩，稱取5g樣品于250mL錐形瓶中，加入分析純乙醚試劑30mL，蓋緊蓋子，超聲提取30min，過濾，濾液揮干后用2mL色譜純甲醇試劑溶解，經(jīng)有機(jī)系13-0.45μm一次性針頭過濾器過濾，所得溶液供試。分析過程中采用的溶劑乙醚為重慶川東化工有限公司分析純，甲醇為北京百靈威公司生產(chǎn)色譜純。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定條件

揮發(fā)性化學(xué)成分的分析儀器為Trace1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)賽默飛公司)。

GC條件 TR-1 MS石英毛細(xì)管柱(30mm×0.25mm×0.25μm);程序升溫：40℃保留2min,以5℃/min的升溫速率升至310℃，保留20min。溶劑切割時(shí)間為4min;柱流量為1.5mL/min;進(jìn)樣口溫度200℃;柱前壓100kPa，進(jìn)樣量2μL;分流比50︰1;載氣為高純氦氣。

MS條件 電離方式EI，電壓1.5kV，傳輸線溫度280℃，離子源溫度230℃，質(zhì)量范圍m/z 40-300，amu采用NIST 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索定性。

2 結(jié)果和分析

2.1 沉香樣品檢測(cè)結(jié)果

所取的11個(gè)白木香樣品提取得到的揮發(fā)性成分經(jīng)GC-MS分析，所得色譜圖見圖1。經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)(NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù))檢索，并結(jié)合譜圖人工解析，查對(duì)有關(guān)質(zhì)譜資料，對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析。

本次取樣共11個(gè)沉香樣品，取樣環(huán)境記錄及揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果見表1。

圖1 5號(hào)沉香樣品總離子流圖

編號(hào)坡向坡度/°海拔/m環(huán)境描述揮發(fā)性成分1355°N南坡18.91 228周圍無雜樹,做過結(jié)香實(shí)驗(yàn),未結(jié)香,土壤較板結(jié)。無2207°SW陰坡30.41 203周圍無雜樹,樹已經(jīng)死亡,螞蟻啃食嚴(yán)重,無明顯結(jié)香,土壤較蓬松。無3228°SW陰坡39.11 214周圍無雜樹,樹已經(jīng)死亡,有螞蟻啃食,樹干木質(zhì)部分還在,無明顯結(jié)香,土壤較板結(jié)。無4260°W陽(yáng)坡25.41 199周圍無雜樹,樹已經(jīng)死亡,僅剩1m左右樹樁,螞蟻啃食嚴(yán)重,去除腐質(zhì)后無明顯結(jié)香,土壤顏色較深,含水率高。無5277°W陽(yáng)坡平地1 228周圍有紫荊茶、松樹和桃花心木。做過結(jié)香實(shí)驗(yàn),樹已經(jīng)死,剩余1.5m左右的樹樁,大量螞蟻啃食,去除腐質(zhì)后有約長(zhǎng)35cm、寬5cm左右的結(jié)香部分,有明顯香味。土壤較蓬松。鑒定出21個(gè)化合物,其中萜烯類物質(zhì)17個(gè),色酮類物質(zhì)4個(gè)。6277°W陽(yáng)坡平地1 225周圍無雜樹,樹已經(jīng)死亡,僅剩1m左右樹樁,螞蟻啃食嚴(yán)重,去除腐質(zhì)后有疑似結(jié)香部分。鑒定出3個(gè)化合物,其中萜烯類物質(zhì)2個(gè),色酮類物質(zhì)1個(gè)。71°N陽(yáng)坡22.11 220周圍無雜樹,做過結(jié)香實(shí)驗(yàn),樹已經(jīng)死亡,樹樁螞蟻啃食嚴(yán)重,去除腐質(zhì)后有疑似結(jié)香部分。無83°N陽(yáng)坡21.91 238周圍無雜樹,做過結(jié)香實(shí)驗(yàn),樹已經(jīng)死亡,樹樁螞蟻啃食嚴(yán)重,去除腐質(zhì)后有結(jié)香部分,土壤顏色較深,較蓬松。鑒定出10個(gè)萜烯類物質(zhì),未檢出色酮類物質(zhì)。9228°SW陰坡39.11 213周圍無雜樹,多雜草,做過結(jié)香實(shí)驗(yàn),樹已經(jīng)死亡,無螞蟻,去除腐質(zhì)后有疑似結(jié)香部分,土壤較蓬松。檢出2物質(zhì),1個(gè)萜烯類物質(zhì),1個(gè)色酮類物質(zhì)。10226°SW陰坡39.11 214周圍無雜樹,做過結(jié)香實(shí)驗(yàn),樹已經(jīng)死亡,樹樁螞蟻有啃食,去除腐質(zhì)后有疑似結(jié)香部分,土壤疏松,含水率較高。無1114°N陽(yáng)坡29.41 216周圍有紫荊茶和雜草,做過結(jié)香實(shí)驗(yàn),樹死且倒伏,有螞蟻啃食,有疑似結(jié)香部分,土壤顏色較深,較蓬松。無

目前已報(bào)道沉香中的揮發(fā)與半揮發(fā)性成分中主要含有多種骨架類型的倍半萜成分、2-(2-苯乙基)色酮類和簡(jiǎn)單揮發(fā)性芳香族成分組成[16-19]。由表1可以看出，僅有5號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)沉香樣品檢出相關(guān)揮發(fā)性化學(xué)成分，其中5號(hào)沉香樣品檢出揮發(fā)性物質(zhì)最豐富，倍半萜和色酮類物質(zhì)均有檢出，與感官鑒別相符。6號(hào)沉香樣品和9號(hào)沉香樣品也檢出微量倍半萜和色酮類物質(zhì)，8號(hào)沉香樣品僅檢出倍半萜物質(zhì)，其它沉香樣品均未檢出相關(guān)化學(xué)成分。因此5號(hào)沉香樣品可以確定為品相、等級(jí)還不錯(cuò)的沉香，即結(jié)香質(zhì)量較好，而6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)沉香樣品品質(zhì)較差，即結(jié)香質(zhì)量較差，其余沉香樣品可視為結(jié)香失敗，檢出的揮發(fā)性成分種類的多少可作為結(jié)香質(zhì)量的判別依據(jù)。

2.2 土壤樣品檢測(cè)結(jié)果及結(jié)香質(zhì)量相關(guān)性

相關(guān)關(guān)系是一種非確定性的關(guān)系，相關(guān)系數(shù)是研究變量之間線性相關(guān)程度的量。簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)：又叫相關(guān)系數(shù)或線性相關(guān)系數(shù)，一般用字母r表示，用來度量?jī)蓚€(gè)變量間的線性關(guān)系。

表2 土壤和沉香樣品檢測(cè)結(jié)果

注：除有機(jī)質(zhì)的單位為g/kg外，其余指標(biāo)的單位為mg/kg。

表3 土壤因子與白木香結(jié)香質(zhì)量相關(guān)系數(shù)

3 討論

3.1 結(jié)香與土壤因子的關(guān)系

土壤是植物生長(zhǎng)的基礎(chǔ)，植物根系和土壤之間不斷進(jìn)行著頻繁的物質(zhì)交換，從而影響其內(nèi)在化學(xué)成分的重要生態(tài)因子[15]。從表3可以看出，與結(jié)香質(zhì)量相關(guān)性較高的土壤因子有pH值、交換性鈣和交換性鎂。結(jié)香質(zhì)量較好的5號(hào)樣品，其土壤pH值顯著高于其它樣品，是相對(duì)中性的土壤促進(jìn)了結(jié)香質(zhì)量的提升，還是結(jié)香后螞蟻等生物以及微生物的作用使得土壤pH值發(fā)生了改變，這個(gè)問題值得深入系統(tǒng)地研究。

5號(hào)樣品、6號(hào)樣品、9號(hào)樣品的有效磷、有效錳、有效鐵和交換性鈣相對(duì)較低，該4項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)低的土壤對(duì)結(jié)香有利還是結(jié)香后其它生物的入侵消耗了土壤中這幾種元素，這也是后續(xù)研究值得關(guān)注的問題。

3.2 結(jié)香與地形的關(guān)系

結(jié)香質(zhì)量較好的樣品中，有3/4的植株生長(zhǎng)在陽(yáng)坡，1/2的植株生長(zhǎng)在平地。陽(yáng)坡光照時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，光合速率較高，平地的土壤水分和土壤養(yǎng)分含量較高，這在很大程度上對(duì)白木香結(jié)香的效果產(chǎn)生了正面的促進(jìn)作用。

次生代謝是植物長(zhǎng)期適應(yīng)外界環(huán)境的結(jié)果，環(huán)境因子對(duì)次生代謝產(chǎn)物含量的影響是由其生態(tài)環(huán)境中各生態(tài)因子，如海拔、溫度、濕度、土壤、光照、大氣以及生物之間的影響程度等綜合決定的，而這些生態(tài)因子并不是孤立地對(duì)植物起作用，而是構(gòu)成一種連續(xù)變化的生態(tài)綜合效應(yīng)，影響著植物的生長(zhǎng)和化學(xué)物質(zhì)形成與變化[21]。白木香結(jié)香過程是一個(gè)比較復(fù)雜的過程，需要外力的傷害，結(jié)合環(huán)境各個(gè)因子的相互作用，以及微生物的介入。本文通過調(diào)查取樣結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析，初步探討了與白木香結(jié)香質(zhì)量相關(guān)的環(huán)境因素，發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子與白木香結(jié)香質(zhì)量有一定關(guān)聯(lián)性，為環(huán)境因子與白木香結(jié)香質(zhì)量相關(guān)的研究方法提供了依據(jù)。深入、系統(tǒng)地研究環(huán)境各因素與結(jié)香質(zhì)量的相關(guān)性分析以及白木香結(jié)香的影響機(jī)制，需要選取更大范圍的樣本，選取不同海拔、不同地形的的白木香樹，用統(tǒng)一結(jié)香方法進(jìn)行結(jié)香實(shí)驗(yàn)，并在結(jié)香實(shí)驗(yàn)前以及結(jié)香過程中對(duì)土壤等相關(guān)環(huán)境因子進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，從而研究哪些環(huán)境因子與白木香結(jié)香質(zhì)量密切相關(guān)以及影響結(jié)香的機(jī)制，為白木香的種植、結(jié)香提供科學(xué)參考。