明膠海綿微粒-TACE治療15例大肝癌術(shù)后外周血Treg細(xì)胞的變化及意義

任志忠， 劉 影， 岳元?jiǎng)祝?楊曉偉， 黃 鑫， 張躍偉

1995 年 Sakaguchi等［1］首次報(bào)道在正常人外周血CD4+T細(xì)胞中有一群持續(xù)高表達(dá)CD25分子的細(xì)胞——調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg），Treg細(xì)胞與腫瘤的免疫逃逸有關(guān)。已有研究證實(shí)，肝癌患者外周血Treg細(xì)胞數(shù)量增加［2］。射頻消融、TACE是治療肝細(xì)胞肝癌（HCC）有效方法，同時(shí)能夠有效降低HCC患者外周血 Treg細(xì)胞含量［3-5］。 明膠海綿微粒（GSMs）-TACE是目前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，術(shù)后腫瘤顯著壞死是療效的病理特征之一。本中心較早應(yīng)用GSMs治療BCLC B期和C期患者取得良好安全性和臨床療效［6］，術(shù)后3 h即可見腫瘤壞死改變。本研究通過(guò)檢測(cè)GSMs-TACE術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)外周血Treg含量水平，初步探討GSMs-TACE對(duì)機(jī)體免疫功能影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016年7月至2018年5月在我院初次行GSMs-TACE的HCC患者15例（見表1）患者平均年齡為（47±12）歲。所有入組肝癌患者按照《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專家共識(shí)條例》，均行2種以上影像檢查或肝腫瘤活檢病理證實(shí)為HCC，選擇患者均為大肝癌：最大腫瘤病灶直徑均＞5 cm。選擇7名志愿者作為健康對(duì)照組。隨訪截止時(shí)間為GSMs-TACE術(shù)后30 d。

表1 肝癌患者一般資料

1.2 方法

1.2.1 GSMs-TACE治療 入組肝癌患者行GSMs-TACE治療。應(yīng)用Seldinger法穿刺右側(cè)股動(dòng)脈，引入RH肝管，常規(guī)行腹腔動(dòng)脈、肝總動(dòng)脈造影。根據(jù)腫瘤部位、大小及腫瘤染色是否完整等情況，結(jié)合影像資料，輔助行膈動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈、右腎動(dòng)脈、肋間動(dòng)脈、胃左動(dòng)脈、胸廓內(nèi)動(dòng)脈等造影，以明確腫瘤所有供血來(lái)源動(dòng)脈。術(shù)中依據(jù)腫瘤大小、微導(dǎo)管超選情況、有無(wú)動(dòng)靜脈瘺及術(shù)前的肝功能評(píng)分，選擇不同直徑的GSMs。應(yīng)用30 mg表柔比星稀釋液與GSMs制成微粒懸浮液。DSA透視下經(jīng)導(dǎo)管緩慢推注化療藥與GSMs懸浮液至腫瘤供血?jiǎng)用}，停止栓塞直至出現(xiàn)血流停滯或?qū)Ρ葎┓戳鳎俅卧煊帮@示腫瘤染色完全消失。術(shù)后常規(guī)給予3～5 d保肝（2到3組保肝藥：多烯磷脂酰膽堿20 mL、還原性谷胱甘肽1.8 g、復(fù)方甘草酸苷15 mL）、補(bǔ)液（總液體量 2 000～2 500 mL）、止吐（昂丹司瓊 8 mg，鹽酸甲氧氯普胺 10 mg）、止痛（地佐辛/6 h）、抗炎（頭孢唑林鈉 1 g，2次/d）、退熱（體溫 38.5℃以下物理降溫，超過(guò)38.5℃賴氨匹林1 g）、抑酸（奧美拉唑40 mg）治療。

1.2.2 血液標(biāo)本采集及標(biāo)本處理 所有患者均簽署知情同意書，在GSMs-TACE術(shù)前1 d和術(shù)后4、10、20、30 d常規(guī)行肝腎功、血常規(guī)、異常凝血酶原、甲胎蛋白檢查，術(shù)后4 d行上腹部CT平掃，術(shù)后30 d行上腹部增強(qiáng)CT或MRI檢查。所有大肝癌患者于GSMs-TACE 術(shù)前 1 d，術(shù)后 10、22 d（15～30 d 的均值）用肝素鈉抗凝劑采血管采集前臂靜脈外周血2 mL，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行外周血Treg細(xì)胞含量的測(cè)定。健康對(duì)照組與肝癌患者GSMs-TACE治療前1 d同時(shí)采集前臂靜脈血2 mL進(jìn)行外周血Treg細(xì)胞含量的測(cè)定，并保存數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 Treg全血處理過(guò)程 ①使用抗凝管收集靜脈穿刺的血液；②取出1個(gè)干粉試劑管（底部已有CD25/CD4/CD127/CD3抗體），加入100 μL的全血于干粉試劑管底部；③旋渦輕振蕩0.5～1 s，混勻。孵育 15 min，室溫（15～25℃），避光；④將 500 μL紅細(xì)胞裂解液加入試管中。孵育15 min，室溫，避光；⑤每測(cè)試管加入PBS溶液2 mL，振蕩，在室溫下離心5 min，離心力為300 g；⑥除去上清液，重復(fù)步驟5一次；⑦除去上清液，每個(gè)試管中加入PBS溶液500 μL。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)；⑧流式圖圈門方案：Treg：CD4+、CD3+；CD25+、CD127+Low的細(xì)胞群。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，兩兩組間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌患者GSMs-TACE術(shù)前與健康人外周血Treg細(xì)胞含量

肝癌患者與健康人對(duì)照組在年齡、性別等一般資料上比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肝癌患者GSMs-TACE術(shù)前Treg細(xì)胞含量，即Treg細(xì)胞（CD25+、CD127+Low）占 Th 細(xì)胞百分比（CD3+、CD4+）為（11.52±3.78）%，健康對(duì)照組 Treg 細(xì)胞含量為（8.64±1.94）%，肝癌患者外周血中Treg細(xì)胞含量顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 GSMs-TACE術(shù)前與術(shù)后 10、22 d外周血中Treg細(xì)胞含量變化

Treg細(xì)胞含量在TACE術(shù)后10 d有所下降（9.07±1.94）%，術(shù)后 22 d 升高至（9.96±1.48）%。外周血Treg細(xì)胞含量在術(shù)后10、22 d與GSMS-TACE術(shù)前比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（見表2）。

表2 15例大肝癌患者GSMs-TACE治療前后外周血Treg細(xì)胞含量比較

2.3 肝癌患者GSMs-TACE治療前后影像學(xué)改變

GSMs-TACE術(shù)中DSA造影顯示肝內(nèi)腫瘤染色，供血?jiǎng)用}來(lái)來(lái)自肝右動(dòng)脈。GSMs-TACE術(shù)后阻斷腫瘤供血?jiǎng)用}，再次造影可見腫瘤染色消失（見圖1）。肝癌患者介入術(shù)后第4天復(fù)查上腹部CT平掃，結(jié)果顯示15例HCC患者肝內(nèi)腫瘤均有不同程度蜂窩狀壞死（見圖2）。

2.4 肝癌患者GSMs-TACE治療前后外周血Treg細(xì)胞流式檢測(cè)圖

GSMs-TACE治療后Treg細(xì)胞含量明顯升高，術(shù)后10 d下降至最低水平，術(shù)后22 d又現(xiàn)升高，但仍低于術(shù)前水平（見圖3）。

3 討論

圖1 大肝癌患者GSMs-TACE術(shù)中DSA造影

圖2 同一例患者手術(shù)前后影像學(xué)檢查

圖3 同一例患者GSMs-TACE治療前后外周血Treg細(xì)胞含量流式檢測(cè)圖

當(dāng)肝癌發(fā)生后，機(jī)體T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中起調(diào)控及免疫監(jiān)視作用。Treg細(xì)胞參與機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗原形成免疫耐受，由于大多數(shù)腫瘤抗原屬于自身抗原，機(jī)體對(duì)早期原發(fā)腫瘤一般處于免疫無(wú)反應(yīng)狀態(tài)，而這種腫瘤免疫耐受的形成與Treg細(xì)胞存在一定關(guān)系［7］。另外，Treg細(xì)胞一旦被激活，可通過(guò)抗原非特異方式抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，從而抑制T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用［8］。

已有研究證實(shí)，HCC患者外周血中Treg細(xì)胞較正常人顯著上升，從腫瘤免疫學(xué)角度證實(shí)HCC的發(fā)生機(jī)制［9］。本研究對(duì)比HCC患者與健康人外周血中Treg細(xì)胞的含量，同樣支持上述結(jié)論。TACE方法雖然是作為無(wú)手術(shù)切除適應(yīng)證HCC有效治療方法，廣泛應(yīng)用臨床實(shí)踐，但多次治療仍有部分患者獲得完全緩解，療效機(jī)制可能與治療前后機(jī)體腫瘤免疫功能狀態(tài)相關(guān)。已有研究證實(shí)，cTACE術(shù)后患者外周血CD4+CD25+/CD4+T細(xì)胞的比例較治療前（11.12±3.58）%，顯著下降至（7.58±2.65）%［5］。

GSMs-TACE相對(duì)傳統(tǒng)cTACE，在肝功能和肝儲(chǔ)備功能良好前提下，徹底栓塞腫瘤供血?jiǎng)用}，術(shù)后腫瘤呈現(xiàn)蜂窩狀壞死改變，腫瘤負(fù)荷短時(shí)間內(nèi)大量減少，同樣表現(xiàn)在如HCC特異性腫瘤標(biāo)記物AFP數(shù)值顯著下降。前期研究證實(shí)，GSMs-TACE方法多次治療巨塊型肝癌，術(shù)后6個(gè)月完全緩解率為25%，而且TACE治療間隔平均時(shí)間為2.6個(gè)月［6］。探討上述臨床現(xiàn)象的原因，除充分閉塞腫瘤供血?jiǎng)用}以阻斷其營(yíng)養(yǎng)來(lái)源外，是否也存在腫瘤呈顯著蜂窩狀壞死病理改變，腫瘤負(fù)荷短時(shí)間內(nèi)大量減輕，進(jìn)而對(duì)機(jī)體免疫功能有正向調(diào)節(jié)作用，這方面研究還未見報(bào)道。

本研究觀察術(shù)后10、22 d外周血中Treg細(xì)胞含量的變化，發(fā)現(xiàn)術(shù)后10 d Treg細(xì)胞含量為（9.07±1.94）%，較術(shù)前（11.52±3.78）%顯著下降，表明腫瘤負(fù)荷的顯著下降有助于改善機(jī)體免疫功能狀態(tài)。繼續(xù)觀察術(shù)后 22 d Treg細(xì)胞含量為（9.96±1.48）%，仍低于術(shù)前基線水平，但較術(shù)后10 d數(shù)值略有升高。GSMs-TACE術(shù)后外周血Treg細(xì)胞的含量先下降后升高可能是肝腫瘤介入術(shù)后出現(xiàn)的液化壞死，在短時(shí)間內(nèi)可能不會(huì)導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，但由于是晚期大肝癌，殘存的肝癌細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，通過(guò)多種作用機(jī)制，從而導(dǎo)致外周血中的Treg細(xì)胞的含量再次升高。上述研究結(jié)果可以初步得出2個(gè)基本結(jié)論：①外周血中Treg細(xì)胞在GSMs-TACE治療后，腫瘤大范圍壞死，腫瘤負(fù)荷顯著減輕，術(shù)后10 d是外周血Treg細(xì)胞最低值，可能是適時(shí)給予免疫輔助治療的最佳時(shí)機(jī)；②機(jī)體免疫功能改善可以在1個(gè)月內(nèi)持續(xù)保持，但可能隨著腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步增殖，機(jī)體免疫功能又逐漸恢復(fù)抑制狀態(tài)，包括GSMs-TACE在內(nèi)的腫瘤后續(xù)治療方法要隨后進(jìn)行，進(jìn)一步減輕腫瘤負(fù)荷，以更好恢復(fù)和提升機(jī)體抗腫瘤的免疫能力。

本研究入組患者例數(shù)較少，初步觀察GSMs-TACE治療HCC對(duì)外周血中Treg細(xì)胞含量影響，初步證實(shí)該方法對(duì)機(jī)體免疫功能可能存在正向調(diào)節(jié)作用。擬進(jìn)一步擴(kuò)大HCC數(shù)量，觀察療效與外周血中Treg細(xì)胞相關(guān)性，從Treg細(xì)胞角度，更加深入探討GSMTACE對(duì)機(jī)體免疫功能影響，從腫瘤免疫學(xué)角度探討GSMs-TACE方法治療HCC，尤其是大肝癌的療效機(jī)制。