解淀粉芽孢桿菌HN固體菌劑發(fā)酵制備技術(shù)研究

張峰峰，周 可，謝鳳行，趙 瓊，趙玉潔

（天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，天津 300192）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）及其代謝產(chǎn)物具有豐富的生物學(xué)活性和廣泛的抗致病菌功能，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鮑曼不動桿菌（Boottanun 等，2017）、黃曲霉（Wang等，2015）等均具有較強的抑制作用，在種植業(yè)中不僅可以促進植物生長，還可防治黃瓜枯萎病（Shao等，2015）、葡萄霜霉?。℅uo 等，2017）等，在養(yǎng)殖業(yè)不僅可以作為飼料添加劑提高養(yǎng)殖生物生產(chǎn)性能（Ahmed等，2014），還可抑制消化道內(nèi)有害微生物，改善動物腸道健康（Selim等，2015），改善免疫功能，提高抗病能力（Reda 等，2015），另外，該菌株還可凈化養(yǎng)殖環(huán)境，防治水體富營養(yǎng)化，抑制藍藻水華（Yu 等，2015；李超等，2011），具有廣闊的應(yīng)用前景。

本實驗室從天津市西青區(qū)污染河溝污泥分離鑒定了一株解淀粉芽孢桿菌HN（Bacillus amyloliquefaciens HN），研究發(fā)現(xiàn)其在不同污染水體中對硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮以及化學(xué)需氧量（COD）等均有很好的去除效果 （Xie等，2013；謝鳳行等，2012），環(huán)境耐受能力強，在較寬的溫度、pH及鹽濃度的范圍內(nèi)都能正常生長（謝鳳行等，2013），且其產(chǎn)胞外淀粉酶和蛋白酶能力均較強（謝鳳行等，2010、2009）。

為了中試生產(chǎn)需要對該菌株進行液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，液體發(fā)酵活菌濃度最高可達41.7×108cfu/mL（謝鳳行等，2013）。然而液體發(fā)酵技術(shù)，對設(shè)備要求高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本高，菌數(shù)低，易污染；而固體發(fā)酵采用的原料一般是廉價的農(nóng)副產(chǎn)品（如豆粕、麩皮等），產(chǎn)用的設(shè)備也較液體發(fā)酵簡單，無需處理大量污水，發(fā)酵產(chǎn)品經(jīng)烘干粉碎不需其他加工處理即可得到固體菌劑，生產(chǎn)成本大大低于液體發(fā)酵（杜英，2013），且固體發(fā)酵產(chǎn)品菌數(shù)、芽孢數(shù)（王卉等，2016；楊柳等，2013）和部分代謝產(chǎn)物含量（Prajapati等，2015；Zhu 等，2013）均高于液體發(fā)酵產(chǎn)品，使用效果更好，且固體發(fā)酵產(chǎn)品干燥后更易于長距離運輸，有利于菌劑更大范圍的推廣和應(yīng)用。為此，本研究對解淀粉芽孢桿菌HN固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進行試驗，以提高固體發(fā)酵產(chǎn)物活菌數(shù)，為生產(chǎn)上進行規(guī)模固體發(fā)酵高濃度菌劑提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料 供試菌種解淀粉芽孢桿菌HN（B.amyloliquefaciens HN）分離自天津市西青區(qū)某污染河溝污泥，由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心進行鑒定，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.3261。

1.2 試驗方法 種子液制備：種子液的制備將30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h的斜面菌株接一環(huán)放入種子培養(yǎng)液中，置于30℃、150r/min下振蕩培養(yǎng)24h，制成含菌量為1.0×109cfu/mL的種子液。液體培養(yǎng)基成分為可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，NaCl 3g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCO31g，水1000mL。

固體發(fā)酵方法：每1000 mL直筒塑料瓶中裝100 g固體物料（以麩皮計）培養(yǎng)基，用封口膜封口，121℃滅菌20 min，冷卻至室溫，接入種子液，混勻后于25～30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，間時拍打，使其均勻生長，培養(yǎng)48 h。稱取10 g固體發(fā)酵物，90 mL無菌水稀釋后，150 r/min下振蕩30 min，涂板進行菌落計數(shù)，重復(fù)3次。各因素在前一因素的最佳水平下逐級優(yōu)化。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 培養(yǎng)基物料對固體發(fā)酵的影響 選取價格低廉的工農(nóng)業(yè)廢棄物麩皮、玉米粉、豆粕、大豆粉等制備基質(zhì)，對菌株進行固體發(fā)酵，121℃滅菌30 min，冷卻后接入HN種子液，30℃ 培養(yǎng)48 h。涂板計數(shù)。

1.3.2 外加碳源、氮源、無機鹽對固體發(fā)酵的影響 為研究外加碳源對固體發(fā)酵的影響分別向固態(tài)基質(zhì)中添加0.2%的可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖、葡萄糖和蔗糖；為研究外加氮源對固體發(fā)酵的影響分別向固態(tài)基質(zhì)中添加0.2%的蛋白胨、胰蛋白胨和酵母浸粉；為研究外加無機鹽對固體發(fā)酵的影響分別向固態(tài)基質(zhì)中添加0.02%的NaH2PO4·2H2O，KH2PO4、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O 和 FeSO4·7H2O，發(fā)酵條件按照30℃培養(yǎng)48 h，菌落計數(shù)，重復(fù)3次。將不添加任何外加物質(zhì)作為空白對照，根據(jù)外源物質(zhì)的單因素篩選結(jié)果，選擇對固體發(fā)酵水平影響較大的可溶性淀粉、 蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O設(shè)計4因素3水平正交試驗。

1.3.3 料水質(zhì)量比對固體發(fā)酵的影響 料水優(yōu)化試驗調(diào)節(jié)培養(yǎng)基料水（水量包括接種的20 mL菌液） 質(zhì)量比為 1∶2、1∶1.5、1∶1.2、1∶1、1∶0.8、1∶0.6、1∶0.4、1∶0.2。

1.3.4 接種量對固體發(fā)酵的影響 接種量優(yōu)化試驗按照5%、10%、15%、20%和25%的接種量接種HN菌懸液；攪拌均勻，30℃培養(yǎng)48 h，菌落計數(shù)，重復(fù)3次。

1.3.5 溫度對固體發(fā)酵的影響 溫度優(yōu)化試驗將發(fā)酵溫度設(shè)置為 20、25、28、33、37 ℃， 培養(yǎng) 48 h，菌落計數(shù)，重復(fù)3次。

1.3.6 最佳培養(yǎng)條件下的生長曲線 時間優(yōu)化試驗分別將固體發(fā)酵物培養(yǎng) 0、6、12、18、24、30、36、42、48 h和 54 h，菌落計數(shù)，重復(fù) 3次。

1.3.7 干燥方法對菌劑菌數(shù)的影響 使用不同的干燥溫度和干燥方法，測定固體菌劑含水量和活菌濃度變化。

1.3.8 固體菌劑的激活試驗 加入無菌水對菌劑進行二次發(fā)酵，測定活菌濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析 試驗結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，運用軟件SPSS 19.0，經(jīng) One-way ANOVA分析，采用Duncan’s多重檢驗分析試驗結(jié)果的差異顯著性，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基物料對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響在固體發(fā)酵過程中，固體底物具有雙重功能，一方面底物可為微生物生長繁殖提供營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面是提供微生物的黏附的功能。固體底物的資源存量、價格和保存時間等是影響其選擇為固體發(fā)酵底物的關(guān)鍵因素，本試驗對HN菌數(shù)影響結(jié)果見圖1。隨著發(fā)酵物料的不同，各個處理固體發(fā)酵的菌數(shù)不同，其中以麩皮為底物的處理菌數(shù)最高，為 2.94×1010cfu/g，顯著高于其他處理（P ＜ 0.05）?？赡苁躯熎の锪媳容^膨松，在HN的生長過程中可提供適宜的好氧環(huán)境，同時可能該菌能夠較容易地破碎麩皮，并利用麩皮中的營養(yǎng)物質(zhì)進行繁殖，在以后的試驗中選取麩皮作為固體發(fā)酵底物。

2.2 外源添加物質(zhì)對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響

圖1 不同固體物料對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響

2.2.1 碳氮源對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響 碳源或氮源對菌數(shù)的影響見圖2。結(jié)果表明淀粉、乳糖、蔗糖等碳源的添加處理和對照未添加碳氮源相比，固體發(fā)酵菌數(shù)有顯著的提高（P＜0.05），而添加葡萄糖處理的菌數(shù)和對照無顯著差異（P＞0.05），而添加麥芽糖處理的菌數(shù)顯著低于對照（P＜0.05）?？紤]到添加碳源物質(zhì)的成本、溶解性和保存的特點，試驗最終選擇淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。選擇的三種氮源添加處理和對照相比，添加蛋白胨和胰蛋白胨的處理菌數(shù)顯著高于對照（P＜0.05），而酵母浸粉和對照相比，無顯著差異（P＞0.05），而蛋白胨具有購買方便、價格較低、容易保存等特點，因此選擇其作為發(fā)酵培養(yǎng)基的基本氮源。

圖2 不同碳氮源添加對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響

2.2.2 無機鹽對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響 無機鹽對菌數(shù)的影響見圖3。與對照相比，添加KH2PO4、MgSO4·7H2O的處理菌數(shù)顯著增加 （P＜0.05），說明這兩種無機鹽對菌體生長具有較好的促進作用，而添加 FeSO4·7H2O、NaH2PO4·2H2O兩種無機鹽處理的菌數(shù)和對照相比無顯著差異（P ＞ 0.05），而添加 MnSO4·H2O 處理的菌數(shù)顯著低于對照，說明MnSO4對菌體的生長有顯著的抑制作用。因此，在HN固體發(fā)酵過程中選擇KH2PO4、MgSO4·7H2O 作為緩沖物和金屬鹽用于固體發(fā)酵。

圖3 不同無機鹽對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響

2.2.3 外源物質(zhì)對HN固體發(fā)酵影響的正交試驗 由極差分析（表1）可知，影響HN固體發(fā)酵的主次因素為可溶性淀粉＞蛋白胨＞KH2PO4＞Mg-SO4·7H2O。最佳水平組合為A2B2C3D3。因此，固體發(fā)酵最優(yōu)外源物質(zhì)組成為可溶性淀粉、蛋白胨、KH2PO4和MgSO4·7H2O，添加量分別為固體物料的0.2%、0.2%、0.1%、0.03%。由表2可知，可溶性淀粉對菌數(shù)的影響達到顯著水平 （P＜0.05），在固體發(fā)酵過程中應(yīng)嚴(yán)格控制可溶性淀粉的使用量，而其他因素影響未達到顯著水平（P ＞ 0.05）。

表1 固體發(fā)酵培養(yǎng)基外源物質(zhì)組分正交試驗結(jié)果

2.3 不同料水比對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響本試驗結(jié)果表明（圖4），隨著水分含量逐漸減小，菌數(shù)出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在料水比為1∶0.8的條件下，菌數(shù)最高，為3×1010cfu/g，顯著高于其他處理（P＜0.05），說明培養(yǎng)基中的水分含量對固

表2 固體發(fā)酵培養(yǎng)基外源物質(zhì)組分正交試驗結(jié)果方差分析

體發(fā)酵菌數(shù)的影響特別明顯，而料水比1∶0.8的處理下，菌株的通氣和營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化達到最佳平衡，既可使固態(tài)基質(zhì)保持疏松，充分利用氧氣的流通和熱量的傳遞；又可為微生物生長提供營養(yǎng)，繁殖產(chǎn)生大量菌體。因此，試驗選擇料水比1∶0.8的處理進行固體發(fā)酵。

圖4 不同料水比對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響

2.4 不同接種量對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響由圖5可知，本試驗中HN菌落數(shù)隨接種量的增加呈先升高后降低的趨勢，接種量為20%時，HN菌落數(shù)達到最大值。

圖5 不同接種量對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響

2.5 不同培養(yǎng)溫度對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響由圖6可知，該菌株在20～37℃均能生長。當(dāng)溫度為28℃時，固體發(fā)酵菌數(shù)最多，為3.69×1010cfu/g，顯著高于其他溫度發(fā)酵物含菌量 （P＜ 0.05），說明28℃為該菌最適宜的固體發(fā)酵溫度。

圖6 不同溫度對HN固體發(fā)酵菌數(shù)的影響

2.6 HN在最優(yōu)條件下的生長曲線 在最優(yōu)培養(yǎng)基和最優(yōu)條件下，菌株HN在18 h進入對數(shù)生長期，在 48 h 達到最大值 3.99×1010cfu/g（圖 7）。菌株HN主要通過菌體細(xì)胞繁殖消耗水體中的有害物質(zhì)從而達到凈化水質(zhì)的目的，因此，HN的固體發(fā)酵周期控制在48 h內(nèi)較為合理。

圖7 HN固體發(fā)酵生長曲線

2.7 不同干燥方法對固體菌劑含水量及活菌數(shù)的影響 由于芽孢桿菌具有較好的耐熱性能，所以，選擇50℃和60℃烘干以及室溫風(fēng)干三種干燥方式，測定不同干燥方式下菌劑含水量和菌濃度的變化。從表3可以看出，采用不同干燥方式，固體菌劑的含水量變化不同，其中在50℃和60℃烘干的條件下，菌劑含水量在24 h內(nèi)均降低至8%以下，而風(fēng)干方式下固體菌劑含水量60 h后降低至9%以下。說明在烘干條件下干燥菌劑較自然風(fēng)干條件下干燥菌劑的效率較高，可提高1倍以上。不同方式的干燥過程中菌數(shù)均有顯著的降低趨勢，到最終干燥結(jié)束（即含水量低于9%），測定在50℃和60℃烘干的條件下，活菌濃度分別為 24.35×108cfu/g 和 30.24×108cfu/g，而在自然風(fēng)干條件下，活菌濃度為49.67×108cfu/g，均顯著低于初始濃度3.8×1010cfu/g。說明干燥過程中由于水分的蒸發(fā)使活菌數(shù)減少較多，且烘干處理的活菌數(shù)顯著低于自然風(fēng)干處理的活菌數(shù) （P＜0.05）。對不同干燥方式測定的含水量和菌數(shù)進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，各個處理的含水量和菌數(shù)的相關(guān)性均達到極顯著相關(guān)（P＜0.01），說明菌劑的活菌數(shù)受菌劑中含水量影響較大，在以后的菌劑生產(chǎn)和使用中要重點考慮水分對菌數(shù)的影響。對比三種干燥方法，如果考慮生產(chǎn)效率，則采用烘干的方法，要考慮菌數(shù)含量，則采取自然風(fēng)干的方法。

表3 干燥方式對HN固體發(fā)酵物含水量和活菌數(shù)的影響

2.8 固體菌劑的激活試驗 由于干燥后活菌數(shù)顯著降低，后期使用過程中如何提高活菌數(shù)成為需要解決的問題。取干燥后的菌劑，按照1∶0.8的料水比例，加入無菌水，28℃培養(yǎng)，進行激活發(fā)酵，定時進行活菌數(shù)測定發(fā)現(xiàn)（圖8），菌劑的活菌數(shù)逐漸增加，在發(fā)酵48 h后，菌劑的活菌數(shù)達到3.72×1010cfu/g，和固體發(fā)酵菌劑干燥前水平相當(dāng)，在以后的實際應(yīng)用中，可以指導(dǎo)用戶加入干凈水進行二次發(fā)酵激活菌劑，從而提高菌劑的菌數(shù)，增強使用效果。

圖8 干燥后菌劑的激活試驗

3 討論

在固體發(fā)酵過程中，固體發(fā)酵基質(zhì)是主要的影響因素。王卉等（2016）則采用花生餅粉∶麩皮∶棉籽粕=53∶35∶12（m∶m∶m）作為基質(zhì)進行解淀粉芽孢桿菌的固體發(fā)酵，最終活菌數(shù)最高為2.13×1010cfu/g；楊柳等（2013）研究結(jié)果也表明麩皮和豆粕為芽孢桿菌最適發(fā)酵基質(zhì)，該發(fā)酵基質(zhì)被分解后不易結(jié)塊，孔隙率和通氣性較好，有利于菌株的生長繁殖。秦宇軒等（2017）選擇麩皮和豆粕的碳氮比為1∶2.8基礎(chǔ)上添加20%的稻谷殼，稻谷殼堅硬的外殼能夠?qū)虘B(tài)基質(zhì)起到有效的支撐作用，以此來增加固態(tài)基質(zhì)中空氣的流動性，從而促進解淀粉芽孢桿菌的生長，菌數(shù)達1.68×1010cfu/g。本研究通過比較不同發(fā)酵基質(zhì)發(fā)現(xiàn)麩皮為最佳的發(fā)酵基質(zhì)，菌數(shù)可達 2.94×1010cfu/g。

固體發(fā)酵物中的碳源和氮源是影響微生物生長繁殖和產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的另一個重要因素。一般常用的外加碳源有葡萄糖、淀粉、蔗糖、麥芽糖和甘油等。外加氮源主要有蛋白胨、豆粉、硫酸銨、硝酸銨和酵母浸粉等。碳氮源質(zhì)量比也非常重要，若碳源過多，菌株可能生長緩慢，易被雜菌污染而失效；氮源過多，微生物就會大量繁殖，不利于次級代謝產(chǎn)物的累積。本試驗最終采用可溶性淀粉作為外加碳源，蛋白胨作為外加氮源，最適濃度均為0.2%。無機離子在固體發(fā)酵過程中也起到重要作用，其能夠調(diào)節(jié)固體發(fā)酵基質(zhì)的酸堿平衡、維持滲透壓、構(gòu)成如蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)的輔基或功能團等，本試驗結(jié)果表明，KH2PO4、MgSO4·7H2O能夠顯著增加菌落總數(shù)，有研究證明MgSO4·7H2O可促進芽孢桿菌生長繁殖，增加酶類等物質(zhì)的分泌活性（Vimala 等，2015）。

料水質(zhì)量比主要通過影響固體發(fā)酵過程中的供氧量和孔隙度來決定固體發(fā)酵的水平，是決定固體發(fā)酵能否成功的重要因素（梁雪杰等，2013）。高料水質(zhì)量比時固態(tài)培養(yǎng)基水分含量過少，會影響溶氧能力和傳遞氧能力，從而限制菌落的生長；低料水質(zhì)量比可使固態(tài)培養(yǎng)基凝結(jié)成塊，導(dǎo)致多孔性、溶氧量和散熱性降低而影響發(fā)酵水平，增加雜菌污染的機率和干燥成本。本試驗料水質(zhì)量比最終采用1∶0.8，一方面可使固態(tài)基質(zhì)保持疏松，充分利用氧氣的流通和熱量的傳遞；另一方面可為微生物生長提供營養(yǎng)。

固體發(fā)酵通常采用菌懸液作為種子培養(yǎng)基，以液固2相的發(fā)酵方式進行，需要合適的接種量。本試驗經(jīng)過優(yōu)化選取20%的接種量，因為接種量較小會延長發(fā)酵周期，成本增大，且會增加雜菌污染機率，影響發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量（梁雪杰等，2013）；接種量過大會加速固體發(fā)酵培養(yǎng)基的消耗，使基質(zhì)中溶氧不足或營養(yǎng)物質(zhì)過度消耗，不利于菌落數(shù)的增加，且菌株產(chǎn)生的次級代謝物會抑制菌落的繁殖，降低菌株固體發(fā)酵的數(shù)量（孫鎮(zhèn)平等，2014）。

固體發(fā)酵的培養(yǎng)溫度是影響菌體生長的重要環(huán)境條件，在液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)HN的最適生長溫度為37℃（謝鳳行等，2013）。本試驗結(jié)果表明，HN的最適發(fā)酵溫度為28℃，究其原因，可能是固體發(fā)酵過程中散熱較液體發(fā)酵慢，菌體自身發(fā)酵產(chǎn)生熱量可促進菌體的生長，如果固體發(fā)酵環(huán)境溫度過高，則會影響菌體的生長。

固體發(fā)酵的時間一般是3～7 d，發(fā)酵時間對微生物繁殖有著重要的影響。發(fā)酵周期短，基質(zhì)營養(yǎng)利用不充分，造成浪費；周期過長，菌體自溶，影響活力，本試驗發(fā)現(xiàn)HN固體發(fā)酵48 h菌數(shù)達到最高值，而后再繼續(xù)發(fā)酵導(dǎo)致固體培養(yǎng)基中氨化嚴(yán)重，物料變黑，氣味刺鼻，嚴(yán)重影響了菌劑的品質(zhì)。

本研究通過優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌HN的固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，確定了最佳固體培養(yǎng)基質(zhì)為麩皮；外源物最優(yōu)添加量（百分比按固態(tài)基質(zhì)質(zhì)量為基準(zhǔn)）為可溶性淀粉0.2%，蛋白胨0.2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.03%，溫度 28 ℃，料水比為1∶0.8，進行 48 h的發(fā)酵，解淀粉芽孢桿菌的菌數(shù)可達3.99×1010cfu/g以上。

固體發(fā)酵后菌劑的干燥過程也是菌劑生產(chǎn)中最重要的環(huán)節(jié)，發(fā)酵產(chǎn)品菌數(shù)較高，干燥效果直接關(guān)系最后菌劑的使用效果。其中菌劑的水分含量是首要的測定指標(biāo)，過高則達不到產(chǎn)品要求，菌劑易發(fā)生霉變，過低則導(dǎo)致菌劑活菌數(shù)過低，影響使用效果。參考NYT 2131-2012《飼料添加劑 枯草芽孢桿菌》菌劑標(biāo)準(zhǔn)，水分含量達到9%以下方為合格菌劑，因此，本研究采用三種干燥方法對菌劑的水分進行去除，在測定含水量使其達到標(biāo)準(zhǔn)的同時測定菌劑中的活菌數(shù)，結(jié)果表明，隨著含水量的減少，菌劑活菌數(shù)也相應(yīng)減少。最終在含水量達到9%以下時活菌數(shù)減少80%以上。其中，自然風(fēng)干處理的活菌數(shù)顯著高于烘干兩個處理的活菌數(shù)，但烘干處理對水分的蒸發(fā)效率顯著高于自然風(fēng)干處理。在以后的規(guī)模生產(chǎn)中，要考慮生產(chǎn)效率和活菌含量平衡的同時，降低成本，尋找出一個更可靠的干燥方法。

二次發(fā)酵激活是很多固體菌劑使用過程中遇到的問題，由于芽孢桿菌芽孢的休眠特性，在菌劑使用前，進行適當(dāng)?shù)募せ畎l(fā)酵，可以提高活菌數(shù)，降低芽孢休眠對使用效果的影響，從本研究中二次發(fā)酵效果表明，激活對菌劑活菌數(shù)的提升具有顯著的效果，在以后的實際應(yīng)用中應(yīng)適當(dāng)?shù)耐茝V應(yīng)用。

本研究均為實驗室內(nèi)控制條件下進行的小規(guī)模發(fā)酵試驗，和生產(chǎn)中的規(guī)模發(fā)酵效果可能會有所差異（Zhu等，2014），因此本研究僅為大規(guī)模生產(chǎn)的固體發(fā)酵條件提供了基礎(chǔ)參考，還需進一步的進行規(guī)模驗證。