丹參胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和細胞大量培養(yǎng)體系的建立

汪海霞，劉艷軍，楊靜慧，張般般，桂 毓，張景新

（1.天津市林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計院，天津 300112；2.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384；3.天津市薊州林業(yè)局，天津 301900）

丹參（Salvia miltiorrhiza）以干燥根及根莖入藥，是我國傳統(tǒng)大宗藥材，具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩之功效。臨床上用于月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，胸腹刺痛，熱痹疼痛，瘡瘍腫痛，心煩不眠，肝脾腫大，心絞痛等。自20世紀70年代以來，臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞等。由于大量采挖和生態(tài)環(huán)境的改變，野生丹參資源逐漸減少，遠遠不能滿足人們的需求。因此，臨床上常以人工栽培丹參替代野生丹參。但是，由于長期的人工栽培和在生產(chǎn)中的只種不選，使丹參生產(chǎn)出現(xiàn)品種退化、品種混雜等現(xiàn)象，致使丹參藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量下降。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以改良丹參品種、提高其品質(zhì)和產(chǎn)量，特別是利用細胞、器官組織培養(yǎng)方法可以直接獲得丹參的有效成分，降低成本、提高效率。所以，組織培養(yǎng)技術(shù)是目前解決丹參栽培中面臨的諸多問題和進行質(zhì)量控制的有效途徑[1]。

近年來，有關(guān)丹參組培研究的報道越來越多，趙東利等[2-8]比較了不同外植體和不同培養(yǎng)基的丹參快繁技術(shù)，認為B5培養(yǎng)基上丹參萌發(fā)腋芽和產(chǎn)生叢生芽的比例較高，效果較好；若以葉為外植體則以MS為基本培養(yǎng)基時誘導(dǎo)的叢生芽最快，可以達到快速繁殖的目的。蔡朝暉等[9-10]在組織培養(yǎng)條件下通過培養(yǎng)基上添加10～50 ppm的秋水仙堿，誘發(fā)出了丹參4倍體。該4倍體植株不僅表現(xiàn)出了多倍體植株各個器官變大的典型特征，而且主要化學(xué)成分含量亦高于對照。為丹參藥材的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)育種奠定了基礎(chǔ)。

人工栽培丹參是為了獲取其作為中藥的藥用物質(zhì)或成分。丹參人工種植需要耗費大量的人力、物力，需要大量的土地和精細的土、肥、水管理。收獲后還需要進一步加工、貯存或提取有效成分。然而，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，可以免去田間生產(chǎn)環(huán)節(jié)，可以節(jié)省土地、降低成本，提高效率；可以直接生產(chǎn)丹參的有效成分、次級代謝產(chǎn)物，具有生產(chǎn)效率高、周期短、有效成分高等優(yōu)點。胡月紅等[11-13]研究發(fā)現(xiàn)通過組織培養(yǎng)獲得的丹參愈傷組織中含有活性成分原兒茶醛和多種二萜醌類化合物。有日本學(xué)者通過組織培養(yǎng)技術(shù)在固定培養(yǎng)基上建立了6個丹參細胞系，其中有1個細胞系(A)可產(chǎn)生兩種萜類物質(zhì)隱丹參酮和鐵銹醇 。有人利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化組織和器官培養(yǎng)生產(chǎn)丹參活性成分。Hu等[14-16]用不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株感染丹參無菌苗，獲得的毛狀根株系；分析顯示其毛狀根中和培養(yǎng)基里均含有7種丹參酮和鐵銹醇成分；毛狀根株系在不含銨鹽的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，細胞中的總丹參酮含量大于43 mg·g-1干重，隱丹參酮含量為20 mg·g-1干重。所以，通過丹參愈傷組織的培養(yǎng)獲得其有效成分的方法是可行的。

胚性愈傷組織是由一些生理代謝十分活躍的細胞組成，這類細胞的基因表達都處于較高水平，包括一些與藥物成分合成相關(guān)的基因也更容易啟動和大量表達，從而獲得更多的藥物有效成分[17]。其次，胚性愈傷組織生長速度較快，可以在短時間內(nèi)生產(chǎn)出更多的藥物[18]。第三，胚性愈傷組織不容易衰老，不會隨著培養(yǎng)時間的增長，生長速度和藥物合成速率下降[19]。

因此，通過胚性愈傷組織的培養(yǎng)，找到丹參藥用成分大量合成的誘導(dǎo)條件，可以達到有目的、高效生產(chǎn)其藥用成分的目的。另外，本研究還可以為丹參的單細胞誘變育種提供大量的試材，因胚性愈傷組織更易于產(chǎn)生變異，并且一旦獲得細胞突變?nèi)菀撰@得再生芽，從而提高誘變效率。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的丹參種子由園林植物實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 丹參無菌苗的培養(yǎng) 選取飽滿、表面光滑的丹參種子在70%的酒精中浸濕30 s，除去酒精后，將種子在40%的安替福民水溶液中消毒處理10 min（期間要不斷搖晃盛有消毒液的三角瓶，使藥劑與種子充分接觸），再將種子用無菌水沖洗3次，每次清洗10 min。最后將消毒后的種子播種在MS培養(yǎng)基上，并放在光照強度為2 000 Lux，25 ℃溫度條件下培養(yǎng)。30 d后當(dāng)幼苗長到3 cm高時用其外植體誘導(dǎo)愈傷組織。

1.2.2 丹參不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)差異比較分別以丹參無菌苗的葉片、根和莖段為外植體，葉片邊緣剪切形成傷口，根與莖段剪切成段，接種到MS+1.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上進行愈傷組織的誘導(dǎo)。每瓶接種6～8塊外植體，每處理5個重復(fù)。每14 d繼代1次，并在繼代轉(zhuǎn)移過程中剔除褐變、稀軟的、生長速度慢的愈傷組織，保留生長速度快，外觀松散、質(zhì)地較硬的黃綠色愈傷組織。培養(yǎng)條件為：溫度23～25 ℃，24 h光照，光照強度為1 000～2 000 Lux。接種后放到培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每3 d觀察1次，并記錄愈傷組織生長情況。

愈傷組織誘導(dǎo)率/%=形成愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種外植體塊數(shù)×100%

1.2.3 激素對丹參胚性愈傷組織生長的影響 將上述誘導(dǎo)出的丹參愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有不同激素的培養(yǎng)基上進行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。取上述愈傷組織，并切割成直徑為3 mm的小塊，轉(zhuǎn)移到含有不同激素配比的培養(yǎng)基上。每瓶接種6塊外植體，重復(fù)5次。培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加7.0 g·L-1瓊脂粉和30 g·L-1蔗糖，pH值調(diào)節(jié)到5.8。培養(yǎng)條件為：每個處理做5個三角瓶。在溫度25 ℃、24 h光照、2 500 Lux光強下培養(yǎng)。每3 d觀察1次，并記錄愈傷組織生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參不同外植體愈傷組織的生長比較

丹參不同外植體在MS+1.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，在外植體的傷口部位即形成愈傷組織。培養(yǎng)30 d后，不同外植體上的愈傷組織明顯不同，具體情況見表1。

表1 丹參不同外植體愈傷組織的生長比較

從表1可以看出，不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)量和質(zhì)量均明顯不同。其中，70%的葉片形成了愈傷組織，100%的莖和根段均形成了愈傷組織。說明丹參容易形成愈傷組織。丹參葉片形成愈傷組織相對困難，與其中分生組織較少有關(guān)。丹參的莖段中有維管形成層和木栓形成層等愈傷組織；根段中除了上述兩種愈傷組織外，還有頂端分生組織。因此，根系和莖段更容易形成愈傷組織。

從誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)量來看，從葉片與莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)地較硬，愈傷組織形成的數(shù)量較少，生長緩慢，主要以白色或淡黃色的愈傷組織為主，這類愈傷組織一般容易隨著培養(yǎng)時間的增加而老化，內(nèi)部褐變并木栓化，無法用于細胞藥用物質(zhì)的生產(chǎn)（圖1）。但是，從根部傷口處誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)地松散、多為黃綠色，細胞數(shù)量多、生長旺盛。因此，選擇根系作為丹參愈傷組織藥用成分培養(yǎng)的外植體。

2.2 激素對丹參胚性愈傷組織生長的影響

將上述丹參根系獲得的松散型愈傷組織切下，轉(zhuǎn)移到含有不同激素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)胚性愈傷組織。培養(yǎng)42 d后（每14 d繼代1次，在繼代時將生長緩慢、褐變的愈傷組織舍棄，保留結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬的愈傷組織），不同處理下的愈傷組織的形態(tài)和生長速率都出現(xiàn)了差異。結(jié)果見表2。

表2 激素對丹參胚性愈傷組織生長的影響

從表2可以看出，在2,4-D濃度不變的情況下，增加BA的濃度（配方1～配方4），愈傷組織的生長速度從快變慢，質(zhì)地也從松散逐漸變得緊密，愈傷組織顏色由白色逐漸變綠，最終變成完全綠色、細胞排列緊密型的愈傷組織（圖1）。高BA濃度培養(yǎng)下的愈傷組織表面細胞分化生長正常，但是內(nèi)部已經(jīng)木栓化，且生長的細胞多數(shù)分化出了厚壁組織、導(dǎo)管等，無法形成胚性細胞。其次，在BA濃度不變，增加2,4-D的用量時（配方7～配方9），結(jié)果正好與上述相反。隨著2,4-D濃度的增加，愈傷組織生長速度加快，質(zhì)地變得松散，但細胞多為個體較大的薄壁細胞，愈傷組織中胚性化細胞——胚性愈傷組織較少，并隨著2,4-D濃度增大，細胞個體增大，細胞中細胞質(zhì)含量減少、液泡增大。因此，只有在適當(dāng)?shù)腂A與2,4-D配比時才能誘導(dǎo)出松散型的胚性愈傷組織（圖1）。因此，綜上所述，誘導(dǎo)丹參松散型胚性愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方為：MS+0.5 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖。

圖1 不同類型愈傷組織的形態(tài)

2.3 繼代培養(yǎng)中激素對丹參松散型胚性愈傷組織生長的影響

將上述誘導(dǎo)出的丹參松散型胚性愈傷組織接種到含有不同激素組合的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后發(fā)現(xiàn)其生長和形態(tài)特征都出現(xiàn)了較大的差異。具體結(jié)果見表3。

表3 繼代培養(yǎng)中激素對丹參松散型胚性愈傷組織生長的影響

從表3可以看出，單獨使用BA或2,4-D時，愈傷組織生長速度會減慢，同時胚性細胞也變成薄壁細胞或進行分化的成熟細胞（配方5和配方6）。因此，必須進行BA與2,4-D配合使用才能保持愈傷組織的胚性特性。當(dāng)增大BA與2,4-D二者的濃度時，愈傷組織既可以保持胚性特性又可以增加生長速度（配方1～配方2）。但是，當(dāng)激素濃度超過1.0 mg·L-1時，愈傷組織胚性特性逐漸消失（配方3和配方4）。因此，配方2中1.0 mg·L-1BA+1.0 mg·L-12,4-D的激素組合的繼代培養(yǎng)效果最好，表現(xiàn)出愈傷組織生長快，愈傷組織始終保持為松散型、淡綠色、細胞較小、分裂旺盛的胚性愈傷組織。這樣的經(jīng)過長期培養(yǎng)形成的大量的愈傷組織，才可能含有較高的藥用成分。綜合上述試驗結(jié)果，本試驗確定的丹參松散型胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)的快速生長的理想培養(yǎng)基配方為：MS+1.0 mg·L-1BA+1.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖。

3 討 論

3.1 外植體類型對不同類型愈傷組織的誘導(dǎo)的影響

在進行愈傷組織誘導(dǎo)過程中，外植體的選擇對于愈傷組織誘導(dǎo)效果影響很大。一般來說。分生組織較多的外植體容易誘導(dǎo)出愈傷組織如莖尖和根尖。愈傷組織一般生長速度主要決定于愈傷組織中分生組織的生長速度，但也受到培養(yǎng)基中滲透壓的影響。含有較多分生組織的外植體除了可以很快誘導(dǎo)出愈傷組織外，還會影響愈傷組織的質(zhì)地與結(jié)構(gòu)，含有較多分生組織的外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織一般為質(zhì)地較硬的緊密型愈傷組織，這類組織在正常培養(yǎng)條件下不能產(chǎn)生松散型的愈傷組織，多數(shù)最終只是在愈傷組織塊的外部形成一層具有生理功能的細胞層，即使分裂也是少數(shù)細胞能夠分裂出胚性化細胞，效率較低。相反，含有較少分生組織的外植體如葉片，由于內(nèi)部處于分化的細胞較少，愈傷組織在一般條件下不容易誘導(dǎo)出來，當(dāng)降低培養(yǎng)基的滲透壓時，一些成熟組織的細胞會吸水膨脹發(fā)育為巨大型薄壁細胞，在短時間內(nèi)這些細胞均不能發(fā)育為較多的愈傷組織細胞。因此，這類愈傷組織一般質(zhì)地過于柔軟，在短時間內(nèi)不能獲得質(zhì)地較硬的松散型愈傷組織，必須經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)與誘導(dǎo)才能逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮⑿陀鷤M織，繼而發(fā)育成松散型胚性愈傷組織。這類愈傷組織在體細胞誘變育種及其它細胞學(xué)研究中用途很多。所以，根據(jù)試驗?zāi)康牟煌?，在進行愈傷組織誘導(dǎo)中適宜的外植體選擇是決定愈傷組織類型的關(guān)鍵。

3.2 2,4-D在愈傷組織培養(yǎng)中的主要作用

2,4-D對于愈傷組織的誘導(dǎo)作用很大，很多植物在缺少2,4-D的情況是無法誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的。這是因為，一是2,4-D可以誘導(dǎo)成熟的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸”诩毎?，即有脫分化的作用；二?,4-D可以使細胞快速生長，尤其是一些通過分生組織誘導(dǎo)出的質(zhì)地較硬的愈傷組織，這些愈傷組織如果沒有2,4-D存在，很容易停止生長，老化或分化成一些成熟組織；第三，2,4-D可以抑制愈傷組織的分化，尤其是抑制器官的分化。在2,4-D存在的情況下，愈傷組織很難分化出根或不定芽，對愈傷組織胚性化也產(chǎn)生一定的抑制作用。本研究的目的是不斷地進行愈傷組織的培養(yǎng)，通過形成大量的愈傷組織來生產(chǎn)丹參的藥用物質(zhì)。所以，保持愈傷組織的旺盛生長是本研究的關(guān)鍵。

3.3 愈傷組織繼代培養(yǎng)中細胞胚性特征的保持

胚性愈傷組織生長更快，細胞分裂更多，細胞的生理狀態(tài)相對穩(wěn)定。在藥用植物生產(chǎn)中需要通過繼代培養(yǎng)保持愈傷組織的胚性。要想在多次繼代后愈傷組織仍然保持一定的胚性，就必須在培養(yǎng)基中保持細胞分裂素與生長素在適當(dāng)?shù)谋壤?，?dāng)二者達到一種平衡狀態(tài)后，愈傷組織就會維持其自身的胚性特性，同時又會保持其快速分裂的愈傷組織的特性。

然而，不同愈傷組織需要不同的激素種類與濃度配比，這在實際操作中必須進行反復(fù)試驗，并根據(jù)生長情況做出相應(yīng)的改變。除了培養(yǎng)基中激素的平衡，還需要注意愈傷組織培養(yǎng)的條件變化。一般認為低溫對于愈傷組織胚性的保持起到一定的效果。此外，光照強度也有影響，強度過高會導(dǎo)致愈傷組織分化，過低會使愈傷組織失去胚性。最后，繼代時也要注意轉(zhuǎn)接愈傷組織團的大小與愈傷組織的質(zhì)地變化，要適當(dāng)做出相應(yīng)的調(diào)整。

4 結(jié) 論

本試驗通過對丹參胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，建立了一套高效的丹參胚性愈傷組織培養(yǎng)體系，具體歸納為以下步驟：采用丹參試管苗的根為外植體，在MS+1.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上可以誘導(dǎo)出理想的松散型愈傷組織；在MS+0.5 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，經(jīng)過3～5次繼代培養(yǎng)可以誘導(dǎo)出胚性愈傷組織；在MS+1.0 mg·L-1BA+1.0 mg·L-12,4-D+30 g·L-1蔗糖的培養(yǎng)基上，丹參的胚性愈傷組織生長速度最快。本試驗結(jié)果將為丹參的體細胞誘變育種和生物制藥研究奠定了基礎(chǔ)。